安氏隱孢子蟲ABC1和ABC2基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)作用研究.pdf

1、隱孢子蟲（Cryptosporidium）引起的隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）是一種全球性的人畜共患病。在免疫正常的人群中，隱孢子蟲只會引起自限性腹瀉，而對于免疫抑制或免疫缺陷者則會引起致死性腹瀉。隱孢子蟲能依靠其膜上 ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Cryptosporidium parvum ATP-bindingcassette transporter，CpABC）進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)（隱孢子蟲的簡化代謝途徑），與此同

2、時還具有多向抗藥性與免疫作用的特性，這也是許多藥物和疫苗對隱孢子蟲病治療無效的主要原因。因此，深入地研究隱孢子蟲 CpABC蛋白，對揭示隱孢子蟲致病機(jī)制，研發(fā)有效的抗隱孢子蟲藥具有重要意義。
　　一，以安氏隱孢子蟲（Cryptosporidium andersoni）基因組 DNA為模板，根據(jù) Genbank中獲得的ATPase基因序列合成 ATPase基因序列的引物。擴(kuò)增出876 bp的基因片段，翻譯得到大小為292 aa的氨基

3、酸序列。
　　二，以安氏隱孢子蟲基因組 DNA為模板，分別根據(jù) Genbank中獲得的CpABC1基因序列合成（Cryptosporidium parvum ATP-bindingcassette transporter1，CaABC1）蛋白基因序列的引物（加酶切位點(diǎn) EcoR I和 Bgl II、起始子 ATG和終止子 TAA）。擴(kuò)增出522 bp的基因片段，翻譯得到大小為174 aa的氨基酸序列。將克隆的重組質(zhì)粒 CaABC1

4、與真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1雙酶切后連接構(gòu)建出重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1-CaABC1，轉(zhuǎn)染到小鼠 IEC細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。之后檢測處理好的空白組、對照組、轉(zhuǎn)染組和加抑制劑組的IEC細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液中的K+、Ca2+、Na+和 Mg2+濃度，發(fā)現(xiàn)4種離子被從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，其中轉(zhuǎn)運(yùn) Ca2+離子效果最明顯。
　　三，以安氏隱孢子蟲基因組 DNA為模板，分別根據(jù) Genbank中獲得的CpABC2基因序列合成 CaAB

5、C2蛋白基因序列的引物（帶有起始子 ATG、終止子 TGA以及酶切位點(diǎn) XhoI、XbaI）。擴(kuò)增出756 bp的基因片段，翻譯得到大小為252 aa的氨基酸序列。將克隆的重組質(zhì)粒 CaABC2與真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1雙酶切后連接構(gòu)建出重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1-CaABC2，轉(zhuǎn)染到小鼠 IEC細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。之后檢測將處理好的空白組、對照組、轉(zhuǎn)染組和加抑制劑組的IEC細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液中的膽固醇、谷胱甘肽、葡萄糖和磷酸酶的