腹瀉小鼠腸道CFTR基因的表達(dá)及離子轉(zhuǎn)運(yùn)作用研究.pdf

1、CFTR是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）中的一員，是一種Cl-離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，它提供了一種Cl-穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的路徑，在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)Cl-跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，除了作為液體流動(dòng)及離子濃縮的中心外，CFTR還能決定鹽分的跨上皮膜運(yùn)輸，因此，CFTR在腹瀉的發(fā)生中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。
　　本課題首先構(gòu)建小鼠的滲透性腹瀉模型，選取腹瀉小鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織為研

2、究對(duì)象，對(duì)小鼠腸道組織中的CFTR進(jìn)行表達(dá)分析、分布及定位檢測(cè)，通過(guò)構(gòu)建CFTR表達(dá)載體的體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，研究CFTR重組蛋白對(duì)與腹瀉相關(guān)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，闡明CFTR蛋白與腹瀉之間的關(guān)系。
　　首先，采用甘露醇灌胃的方法構(gòu)建小鼠腹瀉模型，灌胃40min左右小鼠開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，糞便呈現(xiàn)稀軟狀態(tài)；小鼠的腹瀉癥狀隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)加重趨勢(shì)，糞便呈現(xiàn)水樣。將腹瀉3h、9h的小鼠斷頸處死，取其十二指腸、空腸、回腸及結(jié)

3、腸組織。對(duì)CFTR基因的NBD1、NBD2結(jié)構(gòu)域及NKCC1基因進(jìn)行克隆，PCR及免疫組化結(jié)果均顯示上述三種基因在正常組、腹瀉3h組、腹瀉9h組的十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸組織均有表達(dá)。熒光定量結(jié)果顯示三種基因在不同腸組織中的表達(dá)量存在差異，這可能是由于高滲環(huán)境的存在使得該三種基因的表達(dá)發(fā)生變化。
　　其次以小鼠基因組DNA為模板合成CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行小鼠CFTR蛋白核苷酸結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增、克隆

4、、測(cè)序，分別得到690bp、666bp的基因片段，翻譯成氨基酸序列，大小分別為230aa、222aa，經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)所獲得的CFTR-NBD1和CFTR-NBD2氨基酸序列都存在ABC蛋白家族特征性序列，初步確定本次PCR所擴(kuò)增出的核苷酸產(chǎn)物是小鼠ABC蛋白的一段ATP結(jié)合區(qū)序列。分別將CFTR-NBD1、CFTR-NBD2基因的重組克隆質(zhì)粒與真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1均用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶，切酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，

5、構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2，通過(guò)PCR擴(kuò)增、雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了小鼠CFTR-NBD1、CFTR-NBD2的真核表達(dá)載體。
　　最后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CFTR-NBD1、pEGFP-N1-CFTR-NBD2導(dǎo)入小鼠IEC細(xì)胞內(nèi)，空白組的IEC細(xì)胞未做任何處理，對(duì)照組用空質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染小鼠IEC細(xì)胞，結(jié)果

6、在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組有熒光出現(xiàn)，空白組未見(jiàn)熒光，表明目的基因CFTR-NBD在IEC細(xì)胞中成功表達(dá)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為細(xì)胞外液，收集細(xì)胞并用細(xì)胞破碎儀制成細(xì)胞懸液作為細(xì)胞內(nèi)液，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外液中Na+、K+、Cl-3種離子濃度，并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明在CFTR-NBD蛋白的作用下，這3種離子被從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。因此，確定此次獲得的CFTR-NBD是小鼠CFTR蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)基因，且CFTR-NBD蛋白有離子轉(zhuǎn)

7、運(yùn)功能。
　　綜上所述，本課題首次在滲透性腹瀉小鼠模型中探討CFTR-NBD、NKCC1基因的表達(dá)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-CFTR-NBD，對(duì)小鼠IEC進(jìn)行培養(yǎng)并將CFTR-NBD基因?qū)胄∈驣EC中，使其成功表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)3種離子濃度，發(fā)現(xiàn)CFTR-NBD蛋白有轉(zhuǎn)運(yùn)這3種離子的功能。小鼠CFTR-NBD基因的成功克隆和表達(dá)有望通過(guò)揭示小鼠CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以便找到治療腹瀉的藥物分子的靶位，最終達(dá)到用藥物