分子標記在食用蘑菇主要栽培菌株鑒別中的應用.pdf

1、我國是食用蘑菇生產(chǎn)大國，但是食用蘑菇的菌種互相串引，流通量大使得菌種市場的管理比較混亂，同物異名、同名異物的現(xiàn)象較為普遍，品種知識產(chǎn)權得不到有效保護。食用蘑菇形態(tài)觀察和同工酶分析等鑒定方法由于容易受到環(huán)境變化的影響，所以各種DNA分子標記方法被引入食用菌的分類和鑒定中。本研究以同工酶分析為基礎，結合ITS-RFLP、IGS-RFLP、ISSR和SRAP四種DNA分子標記技術，對我國主要的食用蘑菇栽培菌株進行聚類分析研究，為食用蘑菇栽培菌

2、株的鑒別和遺傳相似性分析等提供可供借鑒的分子標記技術。主要研究結果如下： 1.供試菌株(大肥菇No.3、No.96、No.178、S2，雙孢蘑菇No.1、No.56、U3、No.299、D6、No.1023、No.2796、白杵蘑菇S1、平菇No.9、金針菇No.19、香菇No.9015)在加富。PDA平板上25℃培養(yǎng)，確定了酯酶和過氧化物同工酶培養(yǎng)20 d時，酶帶最清晰，多態(tài)性最好。利用這兩種同工酶酶譜進行聚類分析，在相似水平

3、為60％時可以將供試菌株分成兩個類型，即所有大肥菇、雙孢蘑菇、白杵菇的菌株一類，平菇No.9、金針菇No.19、香菇No.9015聚成另一類。 2.對供試菌株的ITS和IGS擴增產(chǎn)物進行五種限制性內(nèi)切酶(AluⅠ、Hae Ⅲ、HinfⅠ、Msp Ⅰ、RsaⅠ)的單酶切，酶切圖譜進行聚類分析。ITS擴增產(chǎn)物能產(chǎn)生2～4個酶切片段，大小在100 bp～600 bp之間。IGS擴增產(chǎn)物能產(chǎn)生2～7個酶切片段，IGSl酶切片段大小在10

4、0 bp～1，000 bp之間，IGS2酶切片段大小在200 bp～2,000 bp之間。所有酶切圖譜的聚類結果表明，當相似水平為65％時，供試菌株聚成4類，即所有大肥菇、雙孢蘑菇、白杵菇的菌株一類，平菇No.9、金針菇No.19、香菇No.9015各代表一類。 3.從14個ISSR引物中(808<'＃>、809<'＃>、810<'＃>、811<'＃>、812<'＃>、822<'＃>、834<'＃>、835<'＃>、841<'＃

5、>、842<'＃>、852<'＃>、853<'＃>、866<'＃>、868<'＃>)篩選出6個(808<'＃>、810<'＃>、811<'＃>、834<'＃>、835<'＃>、842<'＃>)和從由5個正向引物(me1、me2、me3、me4、me5)與6個反向引物(em1、em2、em3、em4、em5、em6)組成的30對SRAP引物中篩選出7對(me2em1、me2em2、me2em6、me4em1、me5em2、me5em3、m

6、e5em6)能同時對所有供試菌株進行擴增。在優(yōu)化了的ISSR和SRAP的反應條件下，用上述篩選出的引物對供試菌株進行擴增，并對其擴增圖譜進行聚類分析。ISSR結果表明，6個引物共擴增出192條帶，其中98.4％呈多態(tài)性，每個引物可以擴增出28～35條帶，大小由250 bp到2,000 bp左右。SRAP結果表明，7對引物共擴增出211條帶，其中94.3％呈多態(tài)性，每對引物平均擴增出30條帶，大小由100 bp到2,000 bp左右。兩種

7、分子標記的聚類結果基本一致，且與同工酶分析、ITS和IGS酶切圖譜的聚類結果相似。 4.綜合ITS-RFLP、IGS-RFLP、ISSR和SRAP的所有圖譜，對供試菌株進行聚類分析，結果表明當相似水平為61％時，供試菌株分成4類，即所有大肥菇、雙孢蘑菇、白杵菇的菌株一類，平菇No.9、金針菇No.19、香菇No.9015各代表一類。當相似水平為71％時，可以將供試菌株聚成5類，即大肥菇No.3、No.96、No.178歸為第一類