云南省主要推廣核桃品種的分子標記鑒別及遺傳分析.pdf

1、漾濞核桃(JuglanssigillataDode)為云南省重要的經(jīng)濟林樹種之一，隨著云南省核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對于核桃遺傳背景方面知識的需求和應(yīng)用科學(xué)手段鑒別核桃品種，維持核桃市場秩序的需求日益增加。本研究利用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNAs，即隨機擴增多態(tài)性DNA)分子標記和ISSR(Inter-simpleSequenceRepeats簡單序列重復(fù)間區(qū))分子標記技術(shù)對云南省11個漾濞核桃品種進行分

2、子鑒別和遺傳分析。為品種鑒別提供分子水平上的參考，為核桃的育種提供理論依據(jù)。參試的11個核桃品種包括4個云南鄉(xiāng)土核桃品種：漾濞泡核桃、大姚三臺核桃、夾綿核桃和鐵核桃和7個優(yōu)良雜交品種：云新高原核桃(云新7914號)、云新云林核桃(包括：云新7926號、云新8034號、云新8064號)、云新90301號、云新90303號和云新90306號。研究的內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.DNA提?。阂匝ㄅ莺颂也煌L時期的葉片為材料，采取了高鹽低P

3、H法和CTAB沉淀法提取基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計和RAPD擴增3種方法對所提取的DNA樣品進行檢測。比較所得DNA的產(chǎn)量、質(zhì)量，認為不同發(fā)育時期葉片得DNA提取效果不同，其中以冬芽和新葉效果較好，老葉最差；兩種提取方法得到得的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量有所不同，高鹽低PH法提取的DNA純度高，但是產(chǎn)量較低，而CTAB法則相反，產(chǎn)量高，純度低。 2.建立穩(wěn)定的反應(yīng)體系以漾濞核桃中的大姚三臺核桃為實驗材料，通過對影響

4、RAPD擴增結(jié)果的主要因子：Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的濃度組合和擴增程序的試驗研究，確定了漾濞核桃的最適RAPD反應(yīng)體系和擴增程序。即在25uL反應(yīng)體系中包括0.75u.L-1TaqDNA聚合酶，3.0mmol.L-Mg+2，0.3mmol.L-1引物，含1.6mg.L-1模板，2.5ul10×Buffer，dNTPs各0.2mmol.L-1。擴增程序為：94℃預(yù)變性300s，94℃變性40s，36℃退火6

5、0s，72℃鏈延伸120s，45次循環(huán)后，72℃延伸600s。 ISSR反應(yīng)體系和擴增程序為總的20uL反應(yīng)體系中包含：模板DNA1.OuL(50ng)，10×Buffer2.OuL，10pmol.uL-1引物1.5uL，2.5mMdNTPs1.6uL，25mMMg+21.8uL，5UTaqDNA聚合酶0.12uL，ddH2011.98uL；熱循環(huán)體系為：95℃預(yù)變性600s，然后94℃變性30s，50℃退火60s，72℃鏈延伸

6、120s，共35個循環(huán)最后72℃延伸420s。 3.引物篩選通過對RAPD和ISSR引物的篩選，分別篩選出8個能夠擴增出清晰、穩(wěn)定并能擴增出多態(tài)性位點的RAPD引物和ISSR引物。RAPD引物為：SBSA07、SBSA08、SBSB06、SBSE11、SBSF10、SBSS03、SBSS06和SBSS10；ISSR引物及其退火溫度為：ISSR01、ISSR04、ISSR14(退火溫度50℃)，ISSR08、ISSR09、ISSR

7、12、ISSR25(退火溫度52.8℃)和ISSR23(退火溫度48.6℃)。 4.指紋圖譜建立，品種分子鑒別：RAPD引物SBSS06號引物所擴增的位點能夠完全鑒別出11個漾濞核桃品種；ISSR標記的ISSR08和ISSR09這兩條引物結(jié)合能夠鑒別出參試的11個漾濞核桃品種，由此建立了各品種的指紋圖譜。 5.遺傳多樣性：RAPD檢測得到多態(tài)位點(PPB)值為61.63％，平均每條引物獲得6.625個多態(tài)性位點；ISSR

8、檢測，PPB為63.27％，平均每個引物7.75個多態(tài)性位點，說明11個核桃品種間有一定的遺傳差異。POPGENE32軟件分析獲得的遺傳多樣性參數(shù)分另為，RAPD檢測的等位基因數(shù)(Ne)為1.3552，基因的多樣性(H)為0.2110，Shannon信息指數(shù)(I)為0.3188；ISSR檢測的Ne為1.3707，H為0.2143和I為0.3216，以上數(shù)據(jù)表明這11個品種間的遺傳多樣性水平不高。 6.品種間近緣關(guān)系：用RAPD和

9、ISSR檢測所得的Nei's遺傳距離對參試的11個品種進行聚類分析分別繪制聚類圖。RAPD檢測的結(jié)果可以將11個品種分為三組：鄉(xiāng)土優(yōu)良品種(漾泡和三臺核桃)，雜交優(yōu)良品種(14、26、34、64、301、303和306)和品質(zhì)較差的鄉(xiāng)土品種(夾綿核桃和鐵核桃)。ISSR檢測的結(jié)果將11個品種分為4組：兩個云南優(yōu)良鄉(xiāng)土品種、兩個品質(zhì)較差的鄉(xiāng)土品種、親本組合為漾濞泡核桃×云林A7號的4種(云新云林14、26、34、64)和親本組合為三臺核桃