UGT重組酶催化黃酮代謝及其結(jié)構(gòu)-代謝關(guān)系研究.pdf

1、黃酮是一類小分子多酚化合物，廣泛存在于植物源食物中，如水果、蔬菜、豆類、谷類、藥用植物、香科、花、茶以及紅酒當(dāng)中，具有相當(dāng)豐富的含量。黃酮的化學(xué)母核結(jié)構(gòu)，為兩個具有取代基團(tuán)的苯環(huán)通過中間三個碳原子連接而成的一系列化合物，分為A、B、C三個環(huán)。環(huán)上不同的取代基導(dǎo)致了不同的藥理與藥物代謝的活性。根據(jù)其C環(huán)的不同，可以分為：(異)黃酮類、黃酮醇類、二氫(異)黃酮類、查耳酮類、花色素類、黃烷類等。到2002年底，已鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)的黃酮大約有800

2、0多個。作為一種食物源黃酮，不同區(qū)域與生活習(xí)慣的人們每天攝入黃酮量約為50-1000mg不等?，F(xiàn)代研究表明，該類化學(xué)物質(zhì)具有十分廣泛的藥理作用，尤其對心血管系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有明顯的活性。科學(xué)家逐漸認(rèn)識到：蔬菜、水果、中草藥中的植物黃酮對人體健康有著無可替代的重要作用。 黃酮作為一類多酚類化合物，具有多個羥基，易發(fā)生Ⅱ相代謝結(jié)合反應(yīng)，其在體內(nèi)的葡醛酸化是主要的代謝途徑之一。染料木素、芹菜素、槲皮素、山奈酚、黃芩素等黃酮在大鼠或人

3、尿液中均發(fā)現(xiàn)有葡醛酸苷結(jié)合物。大多數(shù)黃酮在生物體內(nèi)都易發(fā)生葡醛酸化，因此研究其代謝途徑及其與重組UGTs的結(jié)構(gòu)．代謝關(guān)系對于生物黃酮的合理利用和此類藥物的合理設(shè)計(jì)具有十分重要的意義。鑒于UGT在黃酮化合物代謝中所起的重要作用，我們采用人重組UGTs進(jìn)行以下三個方面的研究。 一、芹菜素UGTs體外代謝以及主要代謝物活性鑒定有文獻(xiàn)報(bào)道芹菜素在大鼠體內(nèi)外的主要代謝途徑之一為葡醛酸化。本節(jié)實(shí)驗(yàn)通過五種UGT重組酶與芹菜素的代謝作用研究，

4、認(rèn)為代謝物Ml主要由UGTlA6介導(dǎo)催化，代謝物M2主要由UGT1A3和UGT1A9催化，UGT1A6和UGT287也起著較弱的作用，代謝物M3主要由UGT287介導(dǎo)催化，其中UGT1A4幾乎不起催化作用。UGT1A3.1，UGT1A3.4和UG1A3.5對代謝物M2的催化作用顯著高于另外二種UGTA3變異體(UGT1A3.2和UG1lA3.31。芹菜素代謝活性主要由β-葡醛酸水解酶、HPLC-MS和化學(xué)診斷試劑結(jié)合UV數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)。根

5、據(jù)以上數(shù)據(jù)，鑒定代謝物M1為芹菜素．5.葡醛酸苷，M2為芹菜素．7.葡醛酸苷，M3為芹菜素-4'-葡醛酸苷。不同實(shí)驗(yàn)動物與人肝微粒體的代謝結(jié)果表明，在四個種屬的肝微粒體當(dāng)中，芹菜素與兔肝微粒體具有最高的親和力(Kin=36.31lanol.L-1)，對犬肝微粒體具有最低的親和力(Km=120.85μmol.L-1)。不同種屬的芹菜素的代謝速率(Vmax/Km)大小分別為：兔>犬>大鼠>人。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，代謝物M2比底物具有更好的抗氧化

6、能力。而Bac-t0-Bac系統(tǒng)表達(dá)的UGT重組酶對不同有機(jī)溶劑與其它表達(dá)系統(tǒng)相比具有更好的耐受性。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)認(rèn)為，UGT1A6對黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有十分嚴(yán)格的選擇性，只有同時具備5-，7-，4-羥基，且在3-位羥基的黃酮才易被其催化。二、UGT1A3和UGTA9催化黃酮結(jié)構(gòu)．代謝關(guān)系研究在人肝中表達(dá)的UGTlA家族同工酶主要有：UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGTlA6和UGTA9。現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，UGT1A1、UGT1A

7、3和UG"nA9主要催化黃酮化合物，而UGTlA4主要催化胺類，UGT1A6主要催化平面酚類化合物。本節(jié)考察了UGT1A3和UGT1A9與黃酮化合物的效構(gòu)關(guān)系。結(jié)果表明，具有7位羥基的黃酮是UGT1A3、UGT1A9的良好底物，B環(huán)的位置和糖基對其活性具有顯著的影響，而其它的化學(xué)結(jié)構(gòu)也對活性有較小的影響。盡管UGT1A3和UGT1A9的底物庫各自交叉重疊，但又互不相同，呈無規(guī)律性，但其黃酮類底物在本實(shí)驗(yàn)的研究中呈現(xiàn)良好的一致性，除了槲皮

8、素-3-o-呋喃阿拉伯糖苷。經(jīng)酶動力學(xué)參數(shù)的定量研究以及western．blot分析，可以看出UGT1A9與UGT1A3相比，對于黃酮具有更高的代謝活性。這二種UGT對黃酮高效的代謝活性，可能提示了其在體內(nèi)的重要作用。 三、UGT1A3催化黃酮化合物2D-QSMR研究由于定量結(jié)構(gòu)．代謝關(guān)系在藥理活性方面研究甚廣，而在藥物代謝領(lǐng)域主要集中于CYP的研究，如CYP同工酶的底物選擇性與抑制劑特異性研究均取得了較大的進(jìn)展。相對于CYP在

9、代謝預(yù)測和底物特異性描述方面的發(fā)展，UGT則相對落后。通過建立人UGT1A3催化黃酮類化合物定量結(jié)構(gòu)．代謝關(guān)系，考察不同結(jié)構(gòu)參數(shù)對其葡醛酸結(jié)合反應(yīng)的影響。方法為采用半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)計(jì)算法MOPAC-AMl及逐步回歸方法對11個具有類似結(jié)構(gòu)黃酮化合物的結(jié)構(gòu)參數(shù)和UGT1A3催化葡醛酸反應(yīng)的Km進(jìn)行定量結(jié)構(gòu)代謝關(guān)系研究。所建立的QSMR模型(pKm=-2.20707+0.00256HOF+3.21290 Qc5)具有較好的擬合性。由定量結(jié)構(gòu)．