重組釀酒酵母酯代謝酶EHT1、EEB1、TGL3的表達(dá)及其活性研究.pdf

1、酯酶是啤酒酵母產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的重要代謝酶類。目前國內(nèi)對(duì)于釀酒酵母酯代謝酶的研究較少，因此對(duì)重組酯酶的體外催化活性進(jìn)行測定，認(rèn)識(shí)幾種酯酶的催化功能，研究其催化活性的差異，了解酵母酯類代謝酶的調(diào)控作用對(duì)酯類開發(fā)利用有重要意義。
　　 本研究通過構(gòu)建3種酯代謝酶基因eht1(Genbank登錄號(hào)GU471248)、eeb1(Genbank登錄號(hào)GU471249)和tgl3(Genbank登錄號(hào)GU471250)的原核、真核表達(dá)載體，獲得

2、重組酯酶5種，并比較研究了不同重組酯酶的催化活性及其產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的差異。應(yīng)用3種克隆的酯代謝酶基因eht1、eeb1和tgl3與pET28a構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，確定了EHT1和EEB1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，經(jīng)鎳螯合層析法獲得可溶性His-EHT1和His-EEB1重組蛋白，蛋白含量分別達(dá)到1.034 mg/mL和0.683 mg/mL，而TGL3蛋白基本沒有表達(dá)。分別將3種酵母酯酶基因eht1、eeb1

3、、tgl3成功導(dǎo)入畢赤酵母工程菌GS115中，構(gòu)建了GS115/pPIC9k-EHT1，GS115/pPIC9k-EEB1和GS115/pPIC9k-TGL3工程菌。將篩選到的工程菌進(jìn)行三角瓶培養(yǎng)，其誘導(dǎo)條件：pH6.0，甲醇終濃度0.5％(每12h補(bǔ)加一次)，溫度28℃，誘導(dǎo)時(shí)間96～120h，在此條件下，EHT1、EEB1、TGL3蛋白的含量分別達(dá)到100.34mg/L，113.62 mg/L，88.73mg/L。利用生物信息學(xué)軟件

4、對(duì)三種蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)EHT1蛋白和EEB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似。對(duì)三種酯酶糖基化位點(diǎn)預(yù)測，EHT1蛋白中存在4個(gè)糖基化位點(diǎn)，EEB1蛋白中存在2個(gè)糖基化位點(diǎn)，TGL3蛋白中存在2個(gè)糖基化位點(diǎn)。通過水解酯實(shí)驗(yàn)對(duì)不同分子設(shè)計(jì)的重組蛋白進(jìn)行酶活測定，證明其均具有酯水解活性，真核重組蛋白的酶活力和比活力均高于原核重組蛋白。真核重組蛋白EHT1酶比活力為74.569 U/mg；EEB1酶比活力為81.614 U/mg；TGL3酶比活力

5、為34.570 U/mg。通過誘導(dǎo)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)比較EHT1和EEB1的重組畢赤酵母工程菌風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的差異，固相微萃取(SPME)-氣相-質(zhì)譜分析表明，未加甲醇誘導(dǎo)時(shí)發(fā)酵后僅產(chǎn)生苯乙醇，加入甲醇誘導(dǎo)后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)明顯增多，產(chǎn)生了較多酯類，如辛酸乙酯，己酸乙酯，壬酸乙酯，癸酸乙酯等。表明畢赤酵母重組酯酶EHT1和EEB1具有合成催化活性；EEB1、EHT1酯酶在酵母代謝過程中，參與中短鏈脂肪酸脂的代謝合成。重組酯酶制備與功能的研究，為酵母風(fēng)