豬肝羧酸酯酶主要亞型功能性表達及其酶活性比較研究.pdf

1、豬肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase，PLE)是一個由多種同工酶組成的酶家族，它存在于豬的肝臟中。從豬體內(nèi)直接提取的PLE是多種同工酶的混合物，且不同批次提取物的成分和活性差異較大。到目前為止，文獻報道的PLE有7種亞型，分別為PLE1，PLE2，PLE3，PLE4，PLE5，PLE6以及APLE。PLE具有高度的立體選擇性，在水解對映異構(gòu)體的反應(yīng)中能選擇性地水解其中的一種，獲得單一的對映體產(chǎn)物，在功能性單

2、一對映體化合物和藥物中間體工業(yè)生產(chǎn)中起到重要的作用，因而在有機化學(xué)合成領(lǐng)域扮演重要的角色。
　　本研究早期的研究表明，在通城豬和大白豬肝臟中有多種PLE同工酶存在，它們的表達豐度和表達水平與年齡及品種顯著相關(guān)。本研究通過對PLE主要亞型進行原核功能性表達，獲得PLE重組蛋白，測定PLE重組蛋白對通用底物和特異性底物的水解活力，獲得PLE同工酶的水解特征，為進行PLE水解獸藥的研究提供理論依據(jù)。又選取PLE同工酶中氨基酸差異最小且酶

3、活力差異最大的亞型，進行基因定點突變，尋找影響酶活性大小的關(guān)鍵氨基酸，探討影響PLE水解活性的決定因素。
　　本研究在克隆得到多種PLE同工酶eDNA的基礎(chǔ)上，通過對PLE的表達豐度分析，篩選出PLE同工酶中的主要亞型PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13、PLE18，對其進行原核功能性表達。依據(jù)GenBank中PLE1cDNA序列設(shè)計引物。上游引物從去除信號肽之后的核苷酸序列

4、開始，5'端依次加上7個保護性堿基GGAATTC和NdeⅠ酶切位點CATATG;下游引物去除編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號的12個核苷酸(CATGCTGAGCTG)，5'端依次加入3個保護性堿基CCG、XhoⅠ酶切位點CTCGAG和終止密碼子TCA。用課題組前期構(gòu)建的重組pMD18T-PLE為模板，用上述引物擴增PLE的ORF。將PLE基因插入到表達載體pET15b上，構(gòu)建pET15b-PLE原核表達載體。將構(gòu)建的表達載體與分子伴侶質(zhì)粒pGro7在

5、OrigamiTM2(DE3)中進行共表達。首先加入L-阿拉伯糖(L-Arabinose)誘導(dǎo)pGro7表達，接著加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)PLE表達。誘導(dǎo)后離心集菌，破碎菌體收集上清液，用鎳離子親和層析的方法進行純化，SDS-PAGE電泳分析PLE蛋白。用通用底物對硝基苯基乙酸酯(p-NPA)檢測純化PLE的水解活性，重組PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13

6、、PLE18水解p-NPA的活力分別為:3.5U/mg、1.75 U/mg、1.19 U/mg、1.41 U/mg、1.78 U/mg、6.72 U/mg、2.91 U/mg、1.83 U/mg、1.73 U/mg、1.71 U/mg。用自動電位滴定儀測定PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE對特異性底物丁酸甲酯和丁酸己酯的活性，發(fā)現(xiàn)PLE1，PLE2，PLE3，PLE4，APLE優(yōu)先水解丁酸甲酯，而PLE

7、5，PLE6優(yōu)先水解丁酸己酯。
　　筆者對所有已見報道的PLE亞型和本研究新發(fā)現(xiàn)的PLE亞型（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）進行分析，發(fā)現(xiàn)所有亞型都具有相同的活性中心即催化三聯(lián)體(Ser204-Glu336-His449)。但前述研究結(jié)果顯示不同的同工酶水解活力存在差異，表明PLE的活性中心并不能完全決定酶活力的高低，于是筆者對存在于活性中心以外的可能影響因素進行了研究。本研究前期研究共克隆到54種同工酶（已見報道的有7種），根據(jù)同工酶氨基酸序列

8、的相似度將其分為七大類，用大寫字母A～G代表，每一大類型用阿拉伯?dāng)?shù)字進行區(qū)別。從上述54種同工酶中篩選出5組彼此之間氨基酸差異最小的同工酶，為PLE-A8/PLE-A9、PLE-C2/PLE-C3、PLE-D4/PLE-D5、PLE-F3/PLE-F4、PLE-G6/PLE-G7，分別進行原核功能性表達。測定它們對p-NPA的酶活力分別為:1.17U/mg/5.9U/mg、0.99 U/mg/0.63U/mg、40.27U/mg/0.8

9、3U/mg、7.84U/mg/13.29U/mg、1.57U/mg/0.8U/mg，發(fā)現(xiàn)PLE-D4/PLE-D5這組亞型中酶活力相差最大。對PLE-D4和PLE-D5氨基酸全序列進行比對，發(fā)現(xiàn)兩者間共有4個氨基酸不同，分別位于43、92、150、305位。以PLE-D4、PLE-D5為模板對這4個位置的氨基酸分別進行定點突變，獲得8種突變體。對突變體進行原核功能性表達，測定PLE-D4的4種突變體L43P、T92I、A150D、M30

10、5V對p-NPA的酶活力分別為:0.48 U/mg、7.68 U/mg、1.07 U/mg、2.85 U/mg，酶活性相比PLE-D4的40.27 U/mg分別降低84.5倍、5.2倍、37.7倍、14.1倍。PLE-D5的4種突變體P43L、I92T、D150A、V305M對p-NPA的酶活力分別為:1.33 U/mg、2.0 U/mg、0.38 U/mg、0.57 U/mg，酶活性相比PLE-D5的0.83 U/mg，P43L、I9