基于功能篩選的酯酶基因的克隆及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、酯酶(Esterase,EC3.1.1.1),又稱羧酸酯酶,是一類能夠?qū)︳人狨ヵユI作用的水解酶,可以催化不同底物出發(fā)的水解和合成反應(yīng)。如今,酯酶已經(jīng)成為有機合成中重要的生物催化劑,廣泛的應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域。BioH是一種具有雙功能的羧酸酯酶,它既具有酯酶特性,又是在細(xì)菌中驅(qū)動庚二酰-ACP合成生物素的重要酶之一。迄今為止,極少的bioH基因被研究。本研究利用宏基因組的方法,從南美白對蝦養(yǎng)殖基地底泥宏基因組文庫中,通過功能驅(qū)動

2、的篩選方法成功篩選得到了兩個酯酶基因,bioHx和estx基因。這兩個基因所合成的酶均能分解対硝基苯酯類脂肪酸,應(yīng)用pET表達(dá)系統(tǒng)在Escherichia coli BL21中進(jìn)行了表達(dá),對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　本研究通過宏基因組DNA的提取,進(jìn)而構(gòu)建了養(yǎng)殖區(qū)域底泥的宏基因組文庫,在含有三丁酸甘油酯的選擇性平板上進(jìn)行陽性克隆子的篩選,篩選得到具有脂肪酶活性的重組陽性質(zhì)粒兩個。
　　其中一個克隆是4570bp,包

3、含6個基因,分別編碼bioF,bioHx,fabG,bioC, orf和sdh,bioHx編碼的蛋白質(zhì)含有259個氨基酸,蛋白分子量大小為28.60kD,經(jīng)過分析,與已經(jīng)發(fā)表的BioH的氨基酸序列相似性僅為24％～39%,它含有一個五肽聯(lián)合體的修飾中心(Gly76-Trp77-Ser78-Met79-Gly80),同時含有三個氨基酸組成的催化中心(Ser78-His230-Asp202),其所含有的五肽聯(lián)合體以及催化中心均是酯酶的功能中

4、心。BioHx以重組蛋白的形式被表達(dá)和分析,經(jīng)過純化的BioHx蛋白顯示了羧酸酯酶的活性,并且它對対硝基苯酯類脂肪酸的分解條件顯示,其最佳底物是具有4個碳原子的短鏈脂肪酸。通過對其酶學(xué)性質(zhì)的分析,結(jié)果顯示,在金屬離子、非金屬離子溶液及有機溶劑的敏感性測試中,與其他已知的BioH蛋白比較,BioHx在有機溶劑中顯示了具有優(yōu)勢的穩(wěn)定性,是目前已經(jīng)研究的BioH酶中對有機溶劑最穩(wěn)定的。這使得BioHx成為了一種新型的有極強的工業(yè)應(yīng)用價值的羧酸

5、酯酶。
　　另一個克隆長度為2864bp,包含2個基因,分別編碼 esterase和beta-lactamase。estx基因全長1256bp,編碼的蛋白質(zhì)含有419個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量大小為49.80kD,經(jīng)過NCBI Blast分析,此酶與已經(jīng)發(fā)表的酯酶的氨基酸序列相似性為23%～71%。它同樣含有酯酶的功能中心,五肽聯(lián)合體的修飾中心,同時含有三個氨基酸組成的催化中心。此基因編碼的蛋白質(zhì)ESTx同樣以重組蛋白的形式表達(dá)和分析