產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、目的：廣泛篩選、鑒定產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母，對(duì)其產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離、純化及性質(zhì)研究，為進(jìn)一步研究其在果蔬采后真菌病害防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：利用幾丁質(zhì)作唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，從土壤、水果果實(shí)表面以及實(shí)驗(yàn)室保存的菌種中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母；通過(guò)透明圈法和DNS比色法，篩選出酶產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行鑒定及酶純化研究；觀察該酵母菌株個(gè)體和群體培養(yǎng)特征，利用常規(guī)方法進(jìn)行部分生理生化特征鑒定，并以26SrDNA序列為基礎(chǔ)分析該菌株與其

2、他模式菌株的相似性及同源關(guān)系，綜合這幾項(xiàng)特征對(duì)該酵母菌進(jìn)行鑒定；利用硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素(DE32)柱層析、SephadexG-100柱層析對(duì)該酵母產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行純化，結(jié)果用SDS-PAGE驗(yàn)證；利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法研究該酶的基本性質(zhì)，并研究其在平板實(shí)驗(yàn)上對(duì)供試病原菌的拮抗活性。 結(jié)果：1.利用幾丁質(zhì)作唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，分離出9株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母菌(依次編號(hào)為CY-1～CY-9)，發(fā)現(xiàn)CY-6菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，其發(fā)

3、酵液酶活力達(dá)2.41U/mL。 2.通過(guò)觀察CY-6菌株個(gè)體和群體培養(yǎng)特征，進(jìn)行部分生理生化特征鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株的表型特征與陸生伊薩酵母(Issatchenkiaterricola)最為接近。以26SrDNA的D1/D2區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，分析該酵母菌與其他模式菌株序列的相似性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該菌株與陸生伊薩酵母(I.terricola)相似性大于99％，且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚成一亞分支。綜合其形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化特征及26SrDN

4、A序列分析結(jié)果，將該酵母鑒定為陸生伊薩酵母(I.terricola)。 3.以不同的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)該酵母產(chǎn)酶，結(jié)果表明膠體幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)效果最好。通過(guò)純化得到一條分子量約為42.4kD的酶帶，其反應(yīng)的最適溫度和最適pH分別為50℃和7.0，以膠體幾丁質(zhì)為底物的Km和Vmax分別為6.91mg/mL和12.95umol/min。 4.抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，用純化后的酶液對(duì)供試病原菌進(jìn)行平板拮抗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)病原菌菌絲的延伸有不同程度的

5、抑制作用。 結(jié)論：1.分離篩選出9株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母菌，其中CY-6菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，其發(fā)酵液酶活力達(dá)到2.41U/mL。 2.綜合CY-6菌株形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征，結(jié)合26SrDNA序列分析結(jié)果，將該酵母鑒定為陸生伊薩酵母(I.terricola)。 3.純化出該酵母菌產(chǎn)生的一種胞外幾丁質(zhì)酶，測(cè)得該酶的分子量為42.4kD，酶反應(yīng)的最適溫度和最適pH分別為50℃和7.0，以膠體幾丁質(zhì)為底物的Km和Vmax分