伯克霍爾德菌的篩選、脂肪酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用前景巨大，目前對脂肪酶的研究主要是開發(fā)和改造兩個方面，以期獲得有應(yīng)用價值的脂肪酶。本文旨在篩選出產(chǎn)脂肪酶的菌株，構(gòu)建高效重組表達(dá)菌株，實現(xiàn)脂肪酶基因的利用價值。
　　本研究從油污浸泡的土壤獲得樣品，篩選到一株相對較高效的產(chǎn)脂肪酶菌株，命名為BG-01，利用16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)。通過引物設(shè)計，克隆BG-01的脂肪酶基因lipL。lipL開

2、放閱讀框全長1278 bp，編碼425個氨基酸，與Burkholderiagladioli BSR3的脂肪酶基因序列的一致性為98.6％。提交lipL序列信息到GenBank數(shù)據(jù)庫，得到的登錄號為KR023991。經(jīng)生物信息學(xué)分析，LipaseL所屬家族為Lipase_GDSL_2。
　　在pET-22b和pET-32a表達(dá)系統(tǒng)中構(gòu)建4個重組表達(dá)質(zhì)粒并在大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后目的蛋白均形成包涵體。使

3、用大量稀釋法對包涵體目的蛋白成功復(fù)性，復(fù)性后利用重組蛋白C端的6組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行鎳柱純化得到，單一條帶的重組酶JDLipaseL，它的酶活力為118.2U/mg。
　　對復(fù)性的JDLipaseL進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，其最適作用pH為8.5，pH在7-9之間酶活力穩(wěn)定，保持在75％以上，pH適用范圍比較廣。最適作用溫度為55℃，在35℃-75℃溫度范圍內(nèi)，酶活力為最高酶活力的50％以上，屬于中溫酶。以最適作用底物pNPP為反應(yīng)底物，根據(jù)L

4、ineweaver-Burk plot計算出重組酶JDLipaseL的Km值為6.2×10-4M，最大反應(yīng)速度Vmax為161.4μmol/(L·min)。5mM鉀、鋰、鎂、錳離子對酶活影響作用較小，有微弱的促進(jìn)作用，鈣離子的促進(jìn)作用明顯，相對酶活力倍數(shù)為1.3倍，銅離子、鈷離子和三價鐵離子對酶活力均有明顯抑制作用。用10％的不同種有機(jī)溶劑對酶進(jìn)行處理，結(jié)果顯示正丙醇對酶活力有輕微激活作用，甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙三醇、乙腈對酶活