家蠶羧酸酯酶Bmbe2基因的克隆及功能研究.pdf

1、羧酸酯酶(carboxylesterases, COEs)是一種聚合蛋白,是能夠水解酯、硫酸酯和酰胺類的酶,是一種在動物、植物、昆蟲和微生物等生物普遍存在的的多功能酶系。它在殺蟲劑的解毒、激素的降解、神經(jīng)發(fā)生的調(diào)配中起著重要的作用。另外,羧酸酯酶對昆蟲的生殖發(fā)育有調(diào)控作用。在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中,有研究表明雄性附腺表達的羧酸酯酶家族成員 Esterase-6能在交配期間轉(zhuǎn)移到雌性生殖道內(nèi),進而影響

2、雌性果蠅的產(chǎn)卵及交配行為。先前研究者對家蠶的羧酸酯酶家族進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)Bmbe2基因特異地在家蠶雄蛾附腺體內(nèi)表達,而且與Esterase-6高度同源,這預示其對蠶蛾的交配行為可能有作用,但是仍未有相關(guān)研究證實Bmbe2的功能。
　　本研究克隆了家蠶Bmbe2基因,進行了表達譜分析,RNAi實驗研究了其交配行為效應,主要結(jié)果如下:
　　1)Bmbe2基因的克隆及其序列分析
　　依據(jù)NCBI與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫,設計引物并

3、克隆了Bmbe2基因。通過生物學信息分析可獲知Bmbe2基因核苷酸序列長度為1843 bp,編碼氨基酸570個。預測其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為66.4kD,等電點(PI)為5.42,含有1個N-糖基化位點,和41個磷酸化位點。經(jīng)信號肽在線服務預測可獲知Bmbe2,含有32個氨基酸的信號肽,因此這個蛋白可能為分泌蛋白。分析同源和序列相似性可獲知:Bmbe2與 Hacarboxyl/cholineesterase可能為直系同源基因,氨基酸序列相似性

4、為72％。另外Bmbe2是家蠶COEs家族β亞家族成員。
　　2)Bmbe2基因時空表達模式
　　Bmbe2基因在家蠶幼蟲與成蟲的觸角、足、頭部的下顎都有高表達,且Bmbe2在成蟲雄蛾附腺中高表達,預示可能參與交配性行為的調(diào)節(jié)。
　　3)Bmbe2基因的功能初探
　　根據(jù)Bmbe2編碼區(qū)設計3段擴增700bp的干擾引物,覆蓋編碼全部序列,根據(jù)RiboMAX TM Large scale system一T7試劑盒,

5、合成并獲得含有T7啟動子的雙鏈RNA,然后微注射家蠶雄性蛹腹部。通過實時熒光定量 RT-PCR分析,家蠶雄蛾的附腺內(nèi)基因Bmbe2表達下調(diào)。由再交配實驗,發(fā)現(xiàn)干擾后的雄蛾與雌蛾交配,雌蛾的產(chǎn)卵率顯著下降,再交配時間顯著降低,再交配的接受力得到增強。
　　綜上所述,本研究在克隆了Bmbe2基因基礎(chǔ)上,分析了基因序列及其表達特征,然后通過 RNA干擾及再交配實驗,證實了Bmbe2經(jīng)過交配轉(zhuǎn)移,促進了雌蛾產(chǎn)卵率,以及降低了雌蛾接受再交配