mELC重組腺病毒聯(lián)合緩釋脂質(zhì)體治療惡性腹水的研究.pdf

1、EB病毒誘導(dǎo)的分子1配體趨化因子(EBV-induced moleculel ligand chemokine，mELC)屬于CC類趨化因子。能趨化DC、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞等。mELC通過與其受體CCR7的相互作用，促進(jìn)DC細(xì)胞與T細(xì)胞接觸并呈遞抗原從而激發(fā)有效的免疫反應(yīng)。在基因治療中，腺病毒是應(yīng)用最廣泛的病毒載體之一，但是腺病毒具有較強(qiáng)的免疫原性，重復(fù)治療往往導(dǎo)致目的基因在體內(nèi)表達(dá)量的下降，最終影響治療結(jié)果。本實

2、驗構(gòu)建了小鼠ELC的復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Ad-mELC)，采用PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體(PEG-liposome)聯(lián)合Ad-mELC治療小鼠惡性腹水，并對其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 本實驗采用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pShuttle和骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，經(jīng)過在細(xì)菌BJ5183內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-mELC。 pAd-mELC在包裝細(xì)胞293中包裝成熟的腺病毒顆粒。通過噬斑篩選和PCR鑒定重組

3、腺病毒為復(fù)制缺陷型，未含有復(fù)制型腺病毒(Replicaton competent ade- novirus，RCA)。然后用RT-PCR和Western blot方法對Ad-mELC的體外表達(dá)研究顯示，Ad-mELC表達(dá)的mELC的趨化活性通過趨化實驗進(jìn)行了驗證，表明Ad-mELC表達(dá)的蛋白mELC能分泌到細(xì)胞外，并對淋巴細(xì)胞具有趨化活性，并且該活性可以被相應(yīng)mELC單克隆抗體阻斷。同時合成PEG修飾的緩釋脂質(zhì)體PEG-liposome

4、，測定脂質(zhì)體的平均粒徑為151nm，zeta電位38.6mV，性質(zhì)比較穩(wěn)定。并用MTT法分別測定了Ad-mELC和PEG-liposome對腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示Ad-mELC在感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為50-800的范圍內(nèi)對細(xì)胞增殖無明顯影響(P>0.1)，而且當(dāng)PEG-liposome對細(xì)胞的作用濃度為25ng/10<'3>細(xì)胞時，對細(xì)胞也無明顯毒性(P>0.1)。隨后建立小鼠

5、纖維肉瘤MethA腹水模型和肝癌腹水模型，設(shè)定荷瘤小鼠的治療劑量為：Ad-mELC 5×10<'8>pfu/mouse，PEG 0.1mg/mouse。Ad-mELC聯(lián)合PEG進(jìn)行治療(Ad-mELC/PEG)，并設(shè)立相應(yīng)對照組(PBS，PEG，Ad-null，Ad-null/PEG，Ad-mELC)。治療方案分為早期治療(小鼠腹腔接種腫瘤2d后開始治療)和晚期治療(小鼠腹腔接種腫瘤5d后開始治療)兩種。觀察小鼠生存期，結(jié)果顯示，早期治

6、療方案的MethA腹水模型和肝癌腹水模型中，Ad-mELC/PEG組小鼠存活率分別為100％和70％，Ad-mELC組小鼠40d存活率分別為70％和50％，其他對照組在腹腔接種腫瘤后10天相繼死亡。在晚期治療方案中，MethA腹水模型的PBS組小鼠平均生存期為11.2d，Ad-mELC治療組平均生存期為24d。Ad-mELC/PEG治療組小鼠生存期為31.2d，比對照PBS組平均延長了20d，比單純Ad-mELC治療組延長7.2d；在肝

7、癌腹水模型中，PBS對照組小鼠平均生存期為14d，Ad-mELC治療組平均生存期為21.6d。Ad-mELC/PEG治療組小鼠生存期為28d，比PBS對照組平均延長了14d，比Ad-mELC治療組延長6.4d。 當(dāng)小鼠腹腔接種腫瘤第15d后，(即第2次治療結(jié)束后3d)，解剖小鼠并收集腹水，計量腹水體積、腫瘤細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)。MethA腹水模型中，Ad-mELC/PEG治療組和單純Ad-mELC治療組的平均腹水體積為3.2ml和3

8、.3ml，沒有明顯差異(P>0.1)，但與PBS對照組(18.2ml)相比，統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P<0.05)；肝癌腹水模型中，Ad-mELC/PEG治療組和單純Ad-mELC治療組的平均腹水體積分別為3.8ml和4.3ml，沒有明顯差異(P>0.1)，與PBS對照組(15.5ml)相比，統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P<0.05)。結(jié)果表明Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療均明顯抑制了腹水的生長。腹水中紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞數(shù)計數(shù)顯示，MethA

9、腹水模型的PBS對照組腹水中的紅細(xì)胞數(shù)為264×10<'6>/ml，經(jīng)過Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療的小鼠腹水中紅細(xì)胞數(shù)均低于40×10<'6>/ml，比對照組明顯減少(P<0.05)。在肝癌腹水模型中，PBS對照組腹水中的紅細(xì)胞數(shù)為244×10<'6>/ml，經(jīng)過Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療的小鼠腹水中紅細(xì)胞數(shù)均低于100×10<'6>/ml，比對照組也有明顯減少(P<0.05)。 以MethA腹水

10、模型為例，RT-PCR結(jié)果顯示，僅在Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療組小鼠腹水中檢測到mELC表達(dá)。Ad-mELC/PEG和Ad-mELC治療組腹水中VEGF的含量為175pg/ml和189.3pg/ml，比PBS對照組(660pg/ml)明顯降低(P<0.05)。腹膜滲透性檢測結(jié)果顯示，Ad-mELC/PEG和Ad-mELC治療組腹水的滲透性明顯低于其他對照組(P<0.01)。但是隨治療時間延長，Ad-mELC治療組小鼠腹水

11、中mELC表達(dá)量下降，而且與抗腫瘤密切相關(guān)的IL12和INF-γ的表達(dá)也在下降。相反，在Ad-mELC/PEG治療組中，未檢測到上述三種細(xì)胞因子表達(dá)下降，而且在第三次治療結(jié)束后其表達(dá)水平仍高于前兩次治療后測得的表達(dá)水平。 綜上所述，本實驗構(gòu)建了mELC的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-mELC，并聯(lián)合PEG-liposome治療小鼠惡性腹水，結(jié)果顯示聯(lián)合脂質(zhì)體后，Ad-mELC在早期能明顯抑制腹水生長，在晚期治療中，Ad-mELC對小