利用桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)攜帶抗體表達基因的雙鏈AAV的研究.pdf

1、眾所周知，單克隆抗體對于腫瘤療效顯著，基因表達抗體的結(jié)果受所選用載體的影響較大，因此表達載體的選擇在基因治療腫瘤中起著至關(guān)重要的作用。多項臨床研究表明，腺相關(guān)病毒(AAV)不僅能夠有效地介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達且無劑量限制性毒性，因此國內(nèi)外研究中廣泛采用腺相關(guān)病毒載體來作為基因治療載體。常用的單鏈AAV載體具有致病原性低、宿主范圍廣、表達時間長等優(yōu)點，但也存在一些不足，例如表達延遲、表達水平低等;而雙鏈AAV由于越過了由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的過程從而

2、克服了上述缺點。
　　雙鏈AAV的基因組在缺失D序列后，通過自身基因組的折疊形成dsDNA而無需宿主細胞介導(dǎo)的DNA合成或多個載體間的互補配對，從而直接被包裝成為攜帶雙鏈基因組的AAV載體，因此起效時間更快，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高。經(jīng)典的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)AAV具有繁瑣復(fù)雜、費時費力、且難以大規(guī)模培養(yǎng)的缺點，桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)以其高安全性、操作簡單快捷、低成本、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢用于AAV載體的生產(chǎn)吸引了越來越多研究者的目光。國際上已有采用rc

3、AAV表達單鏈抗體的先例，本課題首次嘗試在桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)雙鏈AAV，并包裝表達全長抗體，為AAV—抗體的研究奠定基礎(chǔ)。
　　本課題的主要工作是通過基因改造，使得帶有dsITR序列的質(zhì)粒攜帶抗體表達基因經(jīng)過桿狀病毒重組后，與另一個表達AAV外殼的重組桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sf9細胞，重組產(chǎn)生能夠表達抗體的雙鏈AAV。具體工作內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)對pABVN-EF1a-EGFP質(zhì)粒進行設(shè)計改造得到dspABVN-EF1

4、a-EGFP質(zhì)粒，并將上述兩個質(zhì)粒分別與DH10BacTM感受態(tài)進行轉(zhuǎn)座重組，并經(jīng)PCR反應(yīng)鑒定正確后經(jīng)過對sf9細胞轉(zhuǎn)染后獲得重組桿狀病毒ABVNM-EF1 a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP。
　　(2)對已有的重組桿狀病毒ABPM8進行蛋白印跡(Western blot)檢測，結(jié)果表明ABPM8確已表達Cap蛋白，且三種蛋白的比例約為1∶1∶10。采用Real-time PCR進行滴度檢測，結(jié)果表明獲得的ABP

5、M8、ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1 a-EGFP三種重組桿狀病毒滴度分別為3.1×1010 VG/ml、3.6×1010 VG/ml和3.025×1010 VG/ml。
　　(3)將表達外殼蛋白的ABPM8分別與桿狀病毒ABVNM-EF1 a-EGFP及dsABVNM-EF1 a-EGFP在sf9細胞中進行重組，成功生產(chǎn)出ssrAAV8-EGFP和scrAAV8-EGFP，收集純化后采用感染HEK293細

6、胞來檢測病毒活性并對兩種AAV進行比較，通過表達出的熒光可見scrAAV8-EGFP具有明顯的優(yōu)勢。
　　(4)在上述基礎(chǔ)上本課題構(gòu)建完成了dspABVN-EF1 a-AT7載體，轉(zhuǎn)座重組并經(jīng)PCR鑒定正確后轉(zhuǎn)染sf9細胞，獲得的dsABVNM-EF1 a-AT7桿狀病毒滴度為3.1×109 VG/ml，并與ABPM8重組后生產(chǎn)出scrAAV8-AT7，純化感染HEK293細胞后收集上清，蛋白印跡法檢測出阿瓦斯汀(Avastin)