桿狀病毒保守基因AcMNPV ac53的研究.pdf

1、苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) ac53基因是桿狀病毒基因組中的一個高度保守但功能未知的基因。本文對該基因的轉(zhuǎn)錄、表達以及亞細胞定位進行了系統(tǒng)的研究；同時利用ET—同源重組系統(tǒng)和Bac—to—Bac系統(tǒng)，構(gòu)建了ac53缺失型重組病毒，研究了ac53在病毒復(fù)制中所起的重要作用；在ac53缺失的基礎(chǔ)上，利用定點突變技術(shù)，相繼構(gòu)

2、建出6株ac53點突變補回型重組病毒，對Ac53的功能進行了深入的研究。 ac53基因位于AcMNPV基因組44，712 nt～45，131 nt之間，全長420 bp，編碼140個氨基酸，預(yù)計編碼蛋白的分子量為16.994 kDa。在ac53起始密碼子ATG的上游存在三個典型的桿狀病毒晚期啟動子元件TAAG。序列分析表明，Ac53的氨基酸序列在桿狀病毒中具有高度的保守性，與PlxyMNPV、RoMNPV、BmNPV、MvMN

3、PV的同源蛋白的相似性超過了90％。氨基酸序列的同源比對分析結(jié)果顯示，Ac53中存在一個潛在的鋅指環(huán)蛋白模序。 5'—RACE結(jié)果表明ac53有兩個轉(zhuǎn)錄起始位點，分別位于其ATG上游-15 nt～-12 nt和—45 nt～—42 nt的桿狀病毒典型晚期啟動子模序TAAG中的第二個堿基A。PCR擴增得到ac53全長讀碼框序列，將其克隆到原核表達載體pQE30上，在大腸桿菌中表達出分子量約為17 kDa的融合了六個組氨酸的His—

4、Ac53融合蛋白。以純化的His—Ac53融合蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了Ac53抗血清。免疫印跡分析表明，該抗血清能與感染AcMNPV的細胞總蛋白樣品發(fā)生特異性反應(yīng)。可檢測到大小約為20 kDa的Ac53蛋白(比預(yù)期的16.994 kDa分子量大，推測可能是由于該蛋白發(fā)生了某些翻譯后修飾所致)，且能在感染后(post—infection，p.i.)24 h被檢測出來，并一直持續(xù)到72 h p.i.。這些結(jié)果均表明ac53可能是

5、一個晚期基因。 為了研究Ac53在宿主細胞中的定位情況，我們構(gòu)建了在ac53啟動子控制下表達Ac53GFP(Green Fluorescence Protein，GFP)融合蛋白的重組病毒vAcac53GFP。通過激光共聚焦顯微鏡檢測vAcac53GFP感染的Sf9細胞中綠色熒光的分布情況，追蹤Ac53在宿主細胞中的位置變化。研究結(jié)果表明，在12 h p.i.，融合蛋白出現(xiàn)于細胞質(zhì)中；24 h p.i.時，融合蛋白分布在整個細胞

6、中；48 h p.i.到72 h p.i.，融合蛋白最終定位于緊靠核外膜的細胞質(zhì)區(qū)域。該結(jié)果表明Ac53可能在感染的不同時期分別在核內(nèi)核外行使功能。 為了進一步研究ac53在病毒侵染過程中的生物學(xué)功能，利用ET—同源重組技術(shù)將ac53從AcMNPV Bacmid中成功敲除，構(gòu)建出ac53缺失型重組病毒。同時，利用Bac—to—Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)把αc53基因補回至ac53缺失型重組病毒的多角體蛋白基因(polh)位點，構(gòu)建出ac53

7、補回型重組病毒。將轉(zhuǎn)座后均帶有綠色熒光蛋白基因(gfp)和polh雙標記的三種重組病毒：野生型病毒、ac53缺失型重組病毒和ac53補回型重組病毒分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞，發(fā)現(xiàn)ac53缺失型重組病毒不能產(chǎn)生有感染性的病毒粒子；而ac53補回型重組病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力與野生型基本一致。實時熒光定量PCR的實驗結(jié)果證明，ac53的缺失并沒有影響病毒DNA的復(fù)制。通過對病毒侵染細胞的超薄切片的透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)ac53補回型病毒的表型與野生

8、型病毒完全一致：而在ac53缺失型重組病毒感染的細胞中既有一些正常的核衣殼，又有大量類似核衣殼的空管子。以衣殼蛋白VP39的抗體為一抗進行了免疫電鏡分析，證實了這些空管子是空的核衣殼，表明缺失ac53影響了核衣殼的裝配效率。以上實驗結(jié)果證明ac53是桿狀病毒生活周期的一個必需基因，在核衣殼的裝配過程中具有重要的作用。 利用定點突變技術(shù)對Ac53的類鋅指環(huán)蛋白模序中的5個保守氨基酸位點(Cys29，Cys32，His58，Cys6

9、1，Cys92)分別進行了點突變，并將點突變的ac53與gfp融合，置于在ac53的啟動子下，構(gòu)建了6株重組病毒：vAcac53(M58)GFP、Acac53(M61)GFP、Acac53(M92)GFP、vAcac53(M2932)GFP、vAcac53(M293261)GFP和vAcac53(M293292)GFP。將這6種重組病毒感染細胞后，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)：只有Ac53(M92)GFP融合蛋白的定位情況與野生型Ac53GFP一

10、致；其余5種融合蛋白在感染后的所有時相中都沒有入核，由始至終都定位于細胞質(zhì)的核外膜區(qū)域。這個實驗結(jié)果表明，Ac53的鋅指環(huán)蛋白模序?qū)τ贏c53的入核是必需的。 把以上6種點突變的ac53基因補回至ac53缺失型重組病毒的polh位點，構(gòu)建出6株點突變補回型重組病毒：vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP、Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M29

11、32REP—PH—GFP、vAcac53KO—M293261REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP。熒光顯微鏡觀察結(jié)果、光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果和病毒空斑實驗表明，Acac53KO—M92REP—PH—GFP、vAcac53KO—M2932REP—PH—GFP和vAcac53KO—M293292REP—PH—GFP能形成可感染性病毒粒子，而其余3種點突變補回型重組病毒并不能進行病毒的增殖。這些實驗結(jié)果說明

12、Ac53的鋅指環(huán)蛋白模序?qū)τ诓《玖Ｗ拥脑鲋呈潜匦璧摹?將以上6株點突變補回型重組病毒侵染細胞后制備超薄切片進行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)只有Acac53KO—M92REP—PH—GFP的電鏡觀察結(jié)果與野生型病毒一致，而其余5種點突變補回型重組病毒在它們侵染的細胞中都可以產(chǎn)生正常的核衣殼和大量類似核衣殼的空管子；并且在重組病毒vAcac53KO—M58REP—PH—GFP、Acac53KO—M61REP—PH—GFP和vAcac53KO—