AcMNPV IE-1對桿狀病毒的病毒發(fā)生基質(zhì)的形成具有重要作用.pdf

1、苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ie-1是一個(gè)極早期基因。ie-1基因位于AcMNPV基因組127198 nt～128946 nt之間，全長1749 bp，編碼582個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)編碼蛋白的分子量為66.8kDa。氨基酸序列分析表明，AcMNPV IE-1蛋白在鱗翅目昆蟲桿狀病毒中具有高度的保守性。
　　 本研究利用

2、ET-同源重組系統(tǒng)，在含有AcMNPV基因組的BacmidbMON14272中將ie-1基因成功敲除，構(gòu)建出ie-1缺失型重組病毒。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，把ie-1基因以及綠色熒光蛋白基因(gfp)和多角體蛋白基因(polh)補(bǔ)回至ie-1缺失型重組病毒的多角體蛋白基因位點(diǎn)；同時(shí)，將gfp和polh也插入至bMON14272和ie-1缺失型重組病毒的多角體蛋白基因位點(diǎn)，構(gòu)建出帶有和polh標(biāo)記的ie-1缺失型重組病毒，ie-1補(bǔ)

3、回型重組病毒和野生型病毒。將3種病毒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ie-1缺失型重組病毒不能產(chǎn)生有感染性的病毒粒子；而ie-1補(bǔ)回型重組病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力與野生型基本一致。將ie-1缺失型重組病毒轉(zhuǎn)染后的Sf9細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACSAriaⅡ的GFP(綠色熒光蛋白)分選和透射電鏡觀察，結(jié)果表明無論是轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)，48小時(shí)，還是72小時(shí)，細(xì)胞中都未形成病毒RNA轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制以及核衣殼裝配的核心區(qū)域——病毒發(fā)生基質(zhì)，細(xì)胞的亞

4、顯微結(jié)構(gòu)與未被病毒侵染的Sf9細(xì)胞一致；而對比野生型和ie-1補(bǔ)回型重組病毒侵染細(xì)胞的透射電鏡結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)兩者在細(xì)胞核中都出現(xiàn)了典型的網(wǎng)狀的病毒發(fā)生基質(zhì)，病毒的核衣殼、ODV和多角體結(jié)構(gòu)也清晰可見。同時(shí)，以GFP的抗體為一抗，以偶聯(lián)了膠體金顆粒的Protein-A為二抗的免疫電鏡結(jié)果也表明了在被ie-1缺失型病毒成功轉(zhuǎn)染上的Sf9細(xì)胞中，完全沒有病毒發(fā)生基質(zhì)的產(chǎn)生，沒有宿主細(xì)胞被病毒侵染后的細(xì)胞核膨大現(xiàn)象，也觀察不到任何子代病毒的產(chǎn)生