乙型腦炎重組桿狀病毒疫苗的研究.pdf

1、分類號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文乙型腦炎重組桿狀病毒疫苗的研究StudyontheReeombinantBaculovirusVaceineofJaPaneseEncePhalitis研究生:葉靜指導(dǎo)教師:陳煥春院士指導(dǎo)小組:曹勝波副教授肖少波副教授專業(yè):預(yù)防獸醫(yī)學(xué)獲得學(xué)位名稱:農(nóng)學(xué)碩士研究方向:動(dòng)物病原分子生物學(xué)及基因工程獲得學(xué)位時(shí)間:2008年6月22日華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院二00八年六月3.2，5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化....…

2、…，.................................................................……293.2.6質(zhì)粒的小量制備(改良的堿裂解法)................................................................……293.2.7質(zhì)粒的大量制備(堿裂解法)..........................................

3、..................……，.........……293.2.8脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Lipfectin2000，InvitrogenCp.)..............……303.2.9構(gòu)建重組桿狀病毒的操作流程............................................................................……303.2.10重組穿梭載體(B朗mid)的構(gòu)建.，....

4、..........……，二，..…，.…，.....……，，.……，，…，........……313.2.11重組穿梭載體(Bacmid)的提取.....................................................................……犯3.2.12重組桿狀病毒獲得.............................................................

5、...……323.2.13重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)PK.15細(xì)胞..........................................................................……323.2.14間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的蛋白的體外表達(dá).....................................……323.2.巧M陽(yáng)stemblot檢測(cè)目的蛋白的體外表達(dá).................

6、............................................……323.2.16桿狀病毒介導(dǎo)的表達(dá)JEVE的重組毒疫苗動(dòng)物試驗(yàn).....................................……333.2.17E一ELIsA方法的建立..................................................……333.2.18微量中和試驗(yàn)..................

7、................................................................……，……333.2.19小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離..................................................……，.......……，..............……343.2.20實(shí)時(shí)熒光定量PcR檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞中的IFN一相對(duì)表水平.................

8、……343.2.21IFN理的定量檢測(cè)(雙抗體夾心ELISA)........................................................……353.2.22實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)攻毒小鼠腦組織內(nèi)JEV相對(duì)含量...........................……363.2.23統(tǒng)計(jì)學(xué)方法.......................................................

9、..............……，.....................……36第四章結(jié)果與分析..............................................................................……，二，...……374，1表達(dá)JEvE基因的DNA疫苗peE的構(gòu)建.........................................................

10、........……374.1.1真核表達(dá)質(zhì)粒pe一E的構(gòu)建..................................，一374.1.2pe一E介導(dǎo)E基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)........................................................……384.2表達(dá)JEVE蛋白的重組桿狀病毒BVG一E的構(gòu)建.........................................

11、.........……，.…384.2.1轉(zhuǎn)移載體PFastG一的構(gòu)建................................……，...........................................……384.2.2重組穿梭載體(baCmid一G一E)的構(gòu)建................................................................……394.2.3重組桿狀

12、病毒BVG一E的獲得...........................................................................……404.2.4重組桿狀病毒BVG一E介導(dǎo)E蛋白在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)情況........................……414.2.5重組桿狀病毒BVG一E的純化與毒價(jià)的測(cè)定..............................................

13、......……424.3重組桿狀病毒BV右一E的小鼠免疫試驗(yàn).......................……，.........................................……434.3.1免疫小鼠的ELIsA抗體水平..............................................................................……434.3.2免疫小鼠的中和抗體水平.

14、...……，........................................……，...........................……444.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞中IFN斗mRNA表達(dá)......................……444.3.4ELISA法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN斗水平.............................................……4543

15、.5桿狀病毒BVG一E對(duì)致死性JEV的保護(hù)率........................................................……464.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)攻毒小鼠腦組織中正V含量...........……，...................……47第五章討論與結(jié)論....……，..........................................................

16、.............................................……485.1討論..................................................................................................................................……485.1.1VSVG對(duì)桿狀病毒載體的修飾.............

17、.……，.........................................……，.......……485.1.2桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法....................................................................……495.1.3重組桿狀病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng).....................................……:...........

18、...................……505.1.4重組桿狀病毒對(duì)致死性乙腦強(qiáng)毒的保護(hù)力........................................................……515.2結(jié)論...............................……，...........................................................................