侵染蛋白介導(dǎo)的高效生產(chǎn)重組桿狀病毒研究.pdf

1、1983年，Smith等用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(ACMNPV)作為載體在草地貪夜硪細(xì)胞(Sf9)中高水平表達(dá)了β-干擾素，從而建立了桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，開辟了基因工程研究的新領(lǐng)域。二十多年來，桿狀病毒一昆蟲表達(dá)系統(tǒng)已成為基因工程領(lǐng)域最重要的表達(dá)系統(tǒng)之一，顯示了強(qiáng)大的生命力，被應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域桿狀病毒(Baculovirus)是一類基因組大小在90kb-180kb雙鏈環(huán)狀有囊膜的DNA病毒，在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物，其

2、感染宿主主要集中于鱗翅目昆蟲．桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，可以高效正確表達(dá)真核系統(tǒng)。桿狀病毒表達(dá)真核基因具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：1桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體內(nèi)復(fù)制，桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的外源基因產(chǎn)物能夠進(jìn)行各種翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化折疊和二硫鍵形成等等，而且修飾的情況與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的情況一致或僅存在細(xì)微差異，這些翻譯修飾確保了外源基因產(chǎn)物具有生物活性。2具有強(qiáng)的啟動(dòng)子，桿狀病毒的polh和p10基因是兩種超量表達(dá)基因，其表達(dá)時(shí)間從病

3、毒復(fù)制周期的基因表達(dá)晚期延續(xù)到極晚期，其中polh的表達(dá)產(chǎn)物在病毒感染晚期可以達(dá)到細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的25％～50％。Polh和p10啟動(dòng)子是目前最常用的外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子。3基因容量大，桿狀病毒成棒狀可以延伸，故可以容納更大的病毒基因組。4桿狀病毒的宿主范圍僅限于昆蟲和少數(shù)其它無脊椎動(dòng)物，而且每種桿狀病毒只能感染一種或少數(shù)幾種昆蟲，對宿主昆蟲以外的生物類群無害，尤其是對人類和哺乳動(dòng)物沒有感染性。 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)高效的

4、真核表達(dá)系統(tǒng)，被廣泛用于在昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。無論以何種方式構(gòu)建重組桿狀病毒，最后都必須通過將重組病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生桿狀病毒粒子。目前將DNA載體(包括Bacmid)轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲宿主細(xì)胞的方法有脂質(zhì)體(lipofectamine)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，磷酸鈣-DNA 共沉淀法，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法和顯微注射法。其中磷酸鈣-DNA 共沉淀法對操作要求比較嚴(yán)格，尤其對PH值得精確度要求較高，PH微小的改變就可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效

5、率急劇下降，因此總體轉(zhuǎn)染效率不高。脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法簡單，且效率較高(60-80％之間)，但是脂質(zhì)體價(jià)格極其昂貴，實(shí)驗(yàn)成本太高，依然需要提取和精制DNA后再與脂質(zhì)體進(jìn)行混合。DEAE-葡聚糖，是一種高分子量的多聚陽離子試劑。很多因素影響其轉(zhuǎn)染效率，如DNA濃度，細(xì)胞的數(shù)量，且不能產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，目前很少使用。顯微注射法操作過程煩瑣，需要價(jià)值上百萬的顯微操作系統(tǒng)支持，成本極高，和操作者的經(jīng)驗(yàn)密切相關(guān)，普通實(shí)驗(yàn)室根本不可能使用。以上所有

6、的方法都需要制備高純度的DNA，再通過和試劑進(jìn)行混合才能轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)我們構(gòu)造了一種新的技術(shù)平臺(tái)，可以在invasin侵染蛋白(inv)一種來自Yersinia pseudotuberculosis假結(jié)核耶爾森菌的幫助下，直接使用含目的重組桿狀病毒Bacmid DNA的細(xì)菌感染昆蟲細(xì)胞，從而直接獲得重組病毒，是十分方便，快速和經(jīng)濟(jì)，為大規(guī)模構(gòu)建重組病毒表達(dá)外源蛋白打下基礎(chǔ)．Yersinia psetldotuberculosis是一

7、種革蘭式陰性菌，可以引起鳥類和哺乳動(dòng)物爆發(fā)疾病，人類吃了感染該細(xì)菌的食物或者水，細(xì)菌進(jìn)入人體，到達(dá)回腸末端，通過腸壁進(jìn)入淋巴組織，引起急性腸炎，inv基因是Yersinia pseudotuberculosis來自染色體基因組，編碼986個(gè)氨基酸，103kDa．的細(xì)菌外膜蛋白，可以促進(jìn)細(xì)菌結(jié)合侵染人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。我們利用同源重組構(gòu)建了一種細(xì)胞壁合成缺陷型的大腸桿菌DH10B-asd,asd是編碼二氨基庚二酸的基因，是細(xì)胞壁的重要組成

8、。由于asd基因的缺失，所以必須在培養(yǎng)基中加DAP(二氨基庚二酸)細(xì)菌才能合成細(xì)胞壁，PGB<,2>-inv質(zhì)粒含有inv基因，可以表達(dá)侵染蛋白。我們在這里轉(zhuǎn)化PGB<,2>-inv質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd-，然后電轉(zhuǎn)AcBacmid-gfp進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd-，構(gòu)建菌株DH10B-asd-PGB2Ω-inv，我們將細(xì)菌菌液與昆蟲細(xì)胞sf21直接混合，同時(shí)做脂質(zhì)體介導(dǎo)的AcBacmid-gfp轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。在inv侵染