桿狀病毒DNA甲基化及其在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用初探.pdf

1、病毒感染宿主時(shí)，與宿主相互作用的許多方面涉及表觀遺傳學(xué)修飾，而這一修飾對(duì)某些病毒的感染過(guò)程和結(jié)果至關(guān)重要。已有的與病毒相關(guān)的表觀調(diào)控研究集中在一些潛伏性或非裂解性復(fù)制病毒，而較少關(guān)注裂解性病毒的表觀調(diào)控。本文研究了桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrosis，AcMNPV)在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中進(jìn)行裂解性復(fù)制時(shí)的DNA甲基化情況及其作用。

2、　　首先，通過(guò)使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC探究了低甲基化的細(xì)胞環(huán)境對(duì)AcMNPV復(fù)制的影響。經(jīng)30nM DAC預(yù)處理的細(xì)胞中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1被有效降解，感染后8h的病毒DNA水平是對(duì)照組的8倍，甲基化測(cè)序表明此時(shí)ie0啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平較對(duì)照組低40％，ie1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平則降低50％。測(cè)定病毒的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，30nM的DAC也會(huì)促進(jìn)出芽型病毒BV的產(chǎn)生，使得在感染后的前24h中，病毒粒子釋放較對(duì)照組加快，但是這一差異隨

3、著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而趨于微弱，在最終的病毒效價(jià)上無(wú)明顯差異。這一結(jié)果初步確定了DNA甲基化水平的降低對(duì)病毒的DNA復(fù)制和出芽病毒的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用
　　為了弄清DAC是究竟通過(guò)影響病毒DNA的甲基化而直接影響病毒復(fù)制，還是通過(guò)影響細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài)而間接影響病毒復(fù)制，我們我們進(jìn)行了在DAC存在的細(xì)胞環(huán)境下的病毒連續(xù)傳代的實(shí)驗(yàn)。DNA甲基化測(cè)序證實(shí)，病毒的重要基因ie0，ie1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平隨病毒連續(xù)傳代而持續(xù)降低。將得到的低甲

4、基化病毒進(jìn)行感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種“低甲基化”病毒在前48h內(nèi)DNA復(fù)制拷貝數(shù)平均為對(duì)照病毒的5倍，病毒極早期基因ie0、ie1、ie2和滯早期基因Dnapol、lef1、lef2的轉(zhuǎn)錄活性也有明顯提高。將“低甲基化”的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳細(xì)胞CHO，其介導(dǎo)的外源基因luciferase和egfp的表達(dá)水平也3倍高于對(duì)照病毒，表現(xiàn)出一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　此外，還通過(guò)體外甲基化和瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究了病毒啟動(dòng)子甲基化對(duì)其活性的影響。構(gòu)建了攜

5、帶病毒關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告質(zhì)粒，體外甲基化修飾后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，測(cè)定甲基化修飾對(duì)報(bào)告基因luciferase轉(zhuǎn)錄活性的影響，證實(shí)了病毒的一些關(guān)鍵基因如ie1、pe38的啟動(dòng)子活性受甲基化修飾抑制，出入意料的是，p35、Dnapol、lef1、lef3、lef8的啟動(dòng)子活性受甲基化修飾而略有激活。
　　綜上，DNMT1抑制劑DAC可以促進(jìn)病毒DNA復(fù)制和出芽病毒粒子的釋放。與此相印證，低甲基化病毒感染細(xì)胞，DNA復(fù)制水平有明顯提高