抗Aβ單鏈抗體的桿狀病毒表達(dá)及其干預(yù)Aβ體外聚集的機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的衰老相關(guān)的癡呆，在全球有3560萬(wàn)以上的老人患病。β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid peptide，Aβ）的錯(cuò)誤折疊和聚集是AD的主要病理特點(diǎn)之一。通過(guò)之前的研究，本實(shí)驗(yàn)室已成功獲得Aβ寡聚體偏向的具有潛在治療作用的單克隆抗體A8。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本研究擬構(gòu)建和表達(dá)Aβ的單鏈抗體(single chain variable fragment，scFv)，

2、并研究其對(duì)Aβ聚集-解聚的干預(yù)作用和機(jī)制。
　　方法:1）scFv的表達(dá)、純化和鑒定。根據(jù)之前克隆得到的A8單抗輕重鏈可變區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物，分別在氨基和羧基末端引入組氨酸(His)標(biāo)簽，構(gòu)建重組表達(dá)桿粒;之后通過(guò)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞進(jìn)行scFv的表達(dá)，采用鎳親和層析柱進(jìn)行純化;通過(guò)Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物和純化蛋白的分子量，通過(guò)斑點(diǎn)印跡和間接ELISA等方法對(duì)scFv的抗原識(shí)別能力進(jìn)行初步鑒定。2）構(gòu)建Aβ體外聚集的透射電子

3、顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）測(cè)試實(shí)驗(yàn)體系。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染之后通過(guò)TEM對(duì)Aβ的聚集情況進(jìn)行測(cè)試分析。3）單鏈抗體對(duì)Aβ聚集的雙向干預(yù)。在體外相變模型的體系中，分別研究scFv對(duì)Aβ聚集反應(yīng)的抑制和對(duì)已經(jīng)形成的纖維的降解作用。首先，將Aβ單體與scFv置于選定的反應(yīng)體系中進(jìn)行孵育，分別用反應(yīng)緩沖液和A8單抗做為對(duì)照，觀察與時(shí)間相關(guān)的纖維的形成狀況，研究scFv對(duì)纖

4、維形成的抑制作用。然后，選擇不同的scFv濃度，研究其抑制作用的劑量依賴關(guān)系。最后，在已經(jīng)形成的Aβ纖維樣品（生長(zhǎng)48 h的纖維）中加入scFv繼續(xù)進(jìn)行孵育，以scFv緩沖液做為對(duì)照，研究scFv對(duì)已經(jīng)形成的纖維的降解作用。
　　結(jié)果:1）在桿狀病毒體系中，成功表達(dá)和純化了帶有His標(biāo)簽的scFv，Westernblot結(jié)果表明其分子量為30kDa左右，與預(yù)期大小一致;斑點(diǎn)印跡和間接ELISA的結(jié)果表明所得scFv能夠識(shí)別Aβ寡聚

5、體抗原。2）確立Aβ體外相變模型并優(yōu)化了其反應(yīng)參數(shù)，確定最適合的緩沖液是硼酸緩沖液(pH8.5);在沒(méi)有Aβ預(yù)聚集的情況下，37℃孵育很快就有短纖維形成，約200nm;24h后長(zhǎng)度平均約500nm;在孵育48h之后即可形成明顯的較長(zhǎng)的Aβ纖維，平均1μm;隨著時(shí)間的推移，纖維的長(zhǎng)度和直徑逐漸增加，在96h后會(huì)有纏結(jié)的纖維形成。3）證實(shí)scFv對(duì)Aβ體外聚集的抑制作用。在加入scFv的實(shí)驗(yàn)組中，纖維的長(zhǎng)度明顯較同時(shí)間的對(duì)照組更短(p＜0.

6、01)，表明scFv可以有效的抑制纖維的形成。在已形成的纖維中加入scFv后，作用48h，與緩沖液及單抗對(duì)照組相比，長(zhǎng)纖維明顯變短(p＜0.01)，提示scFv能夠降解事先形成的纖維。在劑量依賴性研究中，可以看到10倍摩爾比的scFv能夠起到抑制纖維形成的作用(p＜0.01)，而1倍和5倍摩爾比的scFv對(duì)纖維形成的抑制效果并不明顯。
　　綜上所述，桿狀病毒體系表達(dá)的抗AβscFv可以有效的抑制Aβ的聚集并對(duì)已經(jīng)形成的纖維有一定的