靶向納米載藥系統(tǒng)DNR-PLGA-PLL-PEg-Tf治療惡性血液病的體內(nèi)、體外研究.pdf

1、目的:
　　目前為止化療仍然是腫瘤系統(tǒng)化治療的主要手段，但是化療的毒副作用限制了其臨床運(yùn)用。為了增加腫瘤藥物的化療效果，減少藥物對正常組織器官的損傷，我們研制一種新型的化療藥物納米運(yùn)載系統(tǒng)DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf靶向治療惡性血液病，并探討其抗腫瘤的機(jī)制。
　　方法:
　　采用高分辯透射電鏡、掃描電子顯微鏡、激光粒度分析儀、紫外分光光度計(jì)對載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf進(jìn)行物理表征。用倒置

2、熒光顯微鏡及流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)的累積。構(gòu)建K562細(xì)胞株荷瘤鼠模型，觀察納米藥物的抑瘤率及藥物的安全性，TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞的凋亡，免疫組化方法檢測凋亡蛋白的表達(dá)，Westernblotting分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。FCM檢測急性白血病原代細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞內(nèi)DNR的累積量。
　　結(jié)果:
　　1、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf納米粒用去離子水分散超聲后通過

3、掃描電子顯微鏡(SEM)和高分辯透射電鏡(HRTEM)觀察到的納米粒形態(tài)大多數(shù)為球型或近似球型。激光粒度分析儀測得納米載藥粒平均粒徑為176.4±11.0 nm，Zeta電位為-19.24±0.12 mV。DNR的包封率和載藥量分別為75.12％±1.68％和5.32％±0.15％。結(jié)果表明DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf納米載藥粒大小、形狀相似、載藥量高、穩(wěn)定，易于保存。
　　2、對于人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞，無論單藥D

4、NR或是載藥納米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf作用于細(xì)胞后，倒置熒光顯微鏡下DNR組和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf-NPs組細(xì)胞內(nèi)均可見DNR分布，后者細(xì)胞內(nèi)DNR濃度高于前者。FCM測得單藥DNR和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf處理K562細(xì)胞后，相對熒光強(qiáng)度(RFI)分別為8.14±0.29和14.26±0.39，二組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3、人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞接種裸鼠成

5、瘤率100％。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白對照組和空白載體納米組的腫瘤體積分別增長至1，099±238mm3和1，034±178 mm3，兩組腫瘤生長速率無明顯差別，且腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。單藥DNR組和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組腫瘤體積分別536±137 mm3和237±85mm3。用藥組腫瘤體積明顯小于空白對照組，有顯著差異(P＜0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組腫瘤體積明顯比單藥DNR組小，具有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，納米藥物抑瘤率比單藥DNR明顯。而且DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組瘤重量明顯低于單藥DNR組，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明載藥納米柔紅霉素抗腫瘤效果優(yōu)于單藥DNR。空白對照組和空白載體納米組的腫瘤組織細(xì)胞凋亡率分別為4.9±0.45％和5.18±0.47％，兩組腫瘤細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。單藥DNR組和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組細(xì)胞凋亡率分別為22.

7、82±1.38％和31.09±2.63％。用藥組腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組，有顯著差異(P＜0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組腫瘤細(xì)胞凋亡率比單藥DNR組高，兩組之間腫瘤細(xì)胞凋亡率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。表明納米載藥系統(tǒng)可以增強(qiáng)化療藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。凋亡蛋白(Caspase9、 Caspase3及c-PARP)在空白對照組和空白載體納米組兩組表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，在用藥組表達(dá)量明顯

8、高于空白對照組，且DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組表達(dá)量高于單藥DNR組，兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）?？瞻讓φ战M和空白載體納米組凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。用藥組Bcl-2表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值明顯低于空白對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf組Bcl-2表達(dá)量及Bcl-2/Bax比值低于單藥DNR組，兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

9、0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米藥物通過內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中裸鼠治療前后體重?zé)o明顯變化，飲食、睡眠、精神等無明顯異常。荷瘤裸鼠重要臟器無明顯損傷，表明納米藥物體內(nèi)安全性良好。
　　4、急性白血病原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力略高于單藥DNR，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);但前者能增加白血病原代細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

10、>　　結(jié)論:
　　1、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf載藥納米粒形狀均勻，載藥量較高，其結(jié)構(gòu)中的PEG成分及顆粒表面連接的Tf使納米載藥顆粒具備了靶向給藥的能力。
　　2、在體外DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf對白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞及急性白血病原代細(xì)胞，可以增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物的累積。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf在體內(nèi)對K562細(xì)胞株荷瘤鼠的腫瘤生長有明顯抑制作用，且安全性良好。我們推測納米粒與腫瘤細(xì)

11、胞特異性結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，隨著納米材料骨架的降解緩慢釋放化療藥物，同時(shí)納米載藥系統(tǒng)可以延長化療藥物在體內(nèi)的半衰期，增加藥物在體內(nèi)的蓄積時(shí)間，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　3、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf通過下調(diào)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2/Bax比值及上調(diào)凋亡蛋白Caspase9、Caspase3及c-PARP的表達(dá)，通過內(nèi)源性的凋亡途徑增加化療藥物誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的能力。
　　4、新型的納米載藥系