熱療聯(lián)合阿霉素治療惡性血液病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 熱療作為一種新的腫瘤治療方法引起了廣泛的關(guān)注,但理論研究的滯后嚴(yán)重影響了腫瘤熱療的臨床實(shí)踐的深入。隨著對(duì)高溫生物學(xué)作用的深入研究以及熱療技術(shù)的提高,熱療作為放療、化療的輔助治療方法,已在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用,被稱(chēng)為第五種治療腫瘤的新方法。
　　 不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞對(duì)加熱的敏感性及其可能的分子生物學(xué)機(jī)制是值得研究和探討的問(wèn)題之一。鹽酸阿霉素(Adriamycin,ADM)作為一種臨床廣泛應(yīng)用的化療藥

2、物,其抗腫瘤的效果顯著,為細(xì)胞周期非特異性藥物,主要用于多種實(shí)體瘤、白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤的全身治療,均有較好的療效。
　　 目前阿霉素的臨床應(yīng)用主要是與其他治療方式或藥物聯(lián)合治療實(shí)體腫瘤,而其與熱療聯(lián)合治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤,目前為止報(bào)道較少,為此,本研究以人慢性髓系白血病敏感細(xì)胞株K562、耐藥細(xì)胞株K562/ADM、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ARH-77為研究對(duì)象,用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀等多種

3、實(shí)驗(yàn)方法研究熱-藥聯(lián)合在體內(nèi)外的抗瘤活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,并初步探討其作用機(jī)制,對(duì)加熱與阿霉素的聯(lián)合作用效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià),并對(duì)全身熱療治療惡性血液病的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)等,為造血系統(tǒng)惡性腫瘤熱療的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一章熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)惡性血液病細(xì)胞株體外抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究目的觀察熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)人慢性髓系白血病敏感細(xì)胞株K562、耐藥細(xì)胞株K562/ADM、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji及人多發(fā)性骨髓瘤

4、細(xì)胞株ARH-77的體外增殖抑制作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法
　　 1.選用K562、K562/ADM、Raji及ARH-77為研究對(duì)象,用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2.采用MTT法確定阿霉素的工作濃度,并以該濃度進(jìn)行化療或與熱療的聯(lián)合。
　　 3.選用不同溫度(40℃、41℃和42℃)和阿霉素為處理因素,采用組內(nèi)分組設(shè)計(jì),共分為8個(gè)組,并設(shè)37℃為對(duì)照組。<

5、br>　　 4.對(duì)K562、K562/ADM、Raji及ARH-77細(xì)胞株分組處理后,臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,并計(jì)算細(xì)胞數(shù)、克隆數(shù)及克隆形成抑制率,以及繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線等。
　　 5.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)各細(xì)胞株不同處理組細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 6.應(yīng)用Veleriote公式判斷藥物聯(lián)合熱療的相互作用類(lèi)型。
　　 7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±

6、標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用LSD法和Tamhane'sT2法。
　　 第二章熱療體外增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究目的觀察熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)人慢性髓系白血病敏感細(xì)胞株K562、耐藥細(xì)胞株K562/ADM、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji及人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株ARH-77細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度變化以及對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2、耐藥蛋白P-gp表達(dá)的影響。
　　 方法
　　 1.選用K56

7、2、K562/ADM、Raji及ARH-77為研究對(duì)象,用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2.采用MTT法確定阿霉素的工作濃度,并以該濃度進(jìn)行化療或與熱療的聯(lián)合。
　　 3.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2、耐藥蛋白P-gp和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的變化。
　　 4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wa

8、yANOVA),組間比較采用LSD法和Tamhane'sT2法。
　　 第三章熱療與阿霉素聯(lián)合作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步研究目的研究阿霉素與熱療聯(lián)合作用對(duì)人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji裸鼠成瘤及腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 方法
　　 將24只BALB/C裸鼠分為4組:對(duì)照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM),每組6只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞,配制成每0.2ml含5×106個(gè)R

9、aji細(xì)胞的懸液,每只裸鼠皮下接種5×106的Raji細(xì)胞,觀察各組裸鼠成瘤時(shí)間、成瘤率、腫瘤體積變化,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。成瘤后3周,處死老鼠,取腫塊稱(chēng)重,計(jì)算抑瘤率,腫瘤組織行常規(guī)病理檢查。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示及單向方差分析(One-wayANOVA),組間比較采用LSD。
　　 第四章全身熱療系統(tǒng)治療惡性血液病15例:加溫、測(cè)溫和控溫技術(shù)的安全、順應(yīng)及有效性觀察目的探

10、討惡性血液病患者對(duì)全身加溫治療的耐受性,驗(yàn)證全身加溫治療的順應(yīng)性、安全性及有效性。
　　 方法
　　 實(shí)驗(yàn)于2005-04～2005-07在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科完成。選擇惡性血液病患者15例,均自愿參加觀察。應(yīng)用廣東威爾醫(yī)學(xué)科技股份有限公司開(kāi)發(fā)研制的WELLRAY光子熱療智能系統(tǒng),對(duì)患者進(jìn)行全身加溫治療。治療前保留導(dǎo)尿,外周靜脈插管,聯(lián)接心電監(jiān)護(hù),固定體表等溫度感受器,關(guān)艙加溫至直腸內(nèi)溫度為40～41℃,保持恒溫2

11、h,同時(shí)監(jiān)測(cè)多部位體表、空氣、治療床的溫度變化,同時(shí)行心電監(jiān)護(hù),加溫治療前及治療后24h行血液常規(guī)和生化等各項(xiàng)指標(biāo)檢查。于全身熱療前及治療后24h分別應(yīng)用Karnofsky(KPS)評(píng)分評(píng)價(jià)患者的生活質(zhì)量,評(píng)分范圍0～100分,100分正常,無(wú)癥狀及體征；10分病危,臨近死亡；0分死亡。
　　 結(jié)果：
　　 第一章熱療聯(lián)合阿霉素對(duì)惡性血液病細(xì)胞株體外抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究1.阿霉素工作濃度的確定:MTT法測(cè)定阿霉素的工作濃度

12、。阿霉素對(duì)K562、K562/ADM、Raji及ARH-77的IC50分別為1.19μg/ml、53.42μg/ml、6.06μg/ml及8.16μg/ml,并以此濃度進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。
　　 2.對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡率的影響:各細(xì)胞株分組處理后48h,與對(duì)照組及熱療組、化療組相比,熱化療組的細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均明顯增加(P<0.05)。
　　 3.與對(duì)照組及熱療組、化療組相比,各細(xì)胞株的熱化療組的克隆形成數(shù)和克隆形成抑制率

13、等指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 第二章熱療體外增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究1.阿霉素工作濃度的確定:MTT法測(cè)定阿霉素的工作濃度。阿霉素對(duì)K562、K562/ADM、Raji及ARH-77的IC50分別為1.19μg/ml、53.42μg/ml、6.06μg/ml及8.16μg/ml,并以此濃度進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。
　　 2.熱化療組耐藥蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)均有下調(diào),與對(duì)照組及熱療組、化療組相比,差異有

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.熱化療組能明顯增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素的藥物濃度(P<0.01)。
　　 第三章熱療與阿霉素聯(lián)合作用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步研究1.成瘤時(shí)間:對(duì)照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM)的腫瘤出現(xiàn)時(shí)間分別為(11.2±1.7)、(20.2±2.3)、(15.3±1.6)及(23.8±1.7)天,熱化療組成瘤時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。
　　 2.

15、生長(zhǎng)曲線顯示:熱化療能明顯減緩Raji細(xì)胞BALB/C裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速度。治療結(jié)束,熱化療組的腫塊較對(duì)照組腫塊明顯縮小。腫塊稱(chēng)重結(jié)果顯示:對(duì)照組(37℃)、化療組(37℃+ADM)、熱療組(42℃)、熱化療組(42℃+ADM)裸鼠的腫瘤重量分別為(3.33±0.57)g、(2.26±0.28)g、(2.76±0.26)g及(1.73±0.33)g,熱化療組的抑瘤率為48.0％。
　　 3.腫瘤組織病理學(xué)改變:成瘤組織經(jīng)HE病

16、理切片及免疫組化鑒定為人B細(xì)胞淋巴瘤,細(xì)胞呈卵圓形,細(xì)胞核呈卵圓形或不規(guī)則形,核仁較明顯,核分離相多見(jiàn)。
　　 第四章全身熱療系統(tǒng)治療惡性血液病15例:加溫、測(cè)溫和控溫技術(shù)的安全、順應(yīng)及有效性觀察納入患者15例,全部進(jìn)入結(jié)果分析,無(wú)脫落。
　　 1.15例惡性血液病患者均能耐受40℃、120min的加熱過(guò)程,具有良好的順應(yīng)性。
　　 2.全身加溫治療后24h,患者的臨床癥狀、體征明顯好轉(zhuǎn),KPS評(píng)分平均提高10分

17、。
　　 3.全身加溫治療前及治療后24h,患者的血常規(guī)和生化等檢查指標(biāo)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.對(duì)細(xì)胞增殖和抑制率的影響:通過(guò)觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、克隆形成、存活率及抑制率等指標(biāo),熱療聯(lián)合化療對(duì)耐藥及敏感細(xì)胞株均有體外抑制作用,對(duì)敏感細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)。
　　 2.對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響:熱療與化療聯(lián)合后,細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組、熱療組及化療組明顯增強(qiáng),并且隨著加熱溫度的增

18、加,細(xì)胞凋亡率也有增加趨勢(shì)。
　　 3.根據(jù)Veleriote法判定熱療聯(lián)合化療的相互作用類(lèi)型:在本實(shí)驗(yàn)條件下,熱化療對(duì)細(xì)胞的作用是協(xié)同作用和次加作用,可見(jiàn)熱療與化療聯(lián)合可以降低化療藥物的使用劑量。
　　 4.加熱可提高敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞內(nèi)的阿霉素藥物濃度,下調(diào)耐藥蛋白P-gp及抗調(diào)亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。
　　 5.本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:熱化療組裸鼠成瘤時(shí)間較各組明顯延長(zhǎng),腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小,抑瘤率較其他各