Ascl12的RNA干擾通過microRNA-302b相關(guān)的途徑抑制結(jié)腸癌前體細胞生長.pdf

1、研究背景及目的：
　　 結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，預后不良，死亡率較高。結(jié)腸癌的治療一直是一大難題，結(jié)腸癌早期診斷率低，而中晚期結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移又使結(jié)腸癌的治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。腫瘤干細胞理論的提出給結(jié)腸癌的治療帶來了新的希望。該理論認為腫瘤干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的種子細胞，在整個腫瘤細胞中僅占少數(shù)，但由于其具有無限增殖和不對稱分裂能力，是惡性腫瘤不斷生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的根源。腫瘤干細胞是整個腫瘤

2、的種子和源泉，是腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的“起始細胞”或“動力細胞”，在整個腫瘤過程中起著至關(guān)重要的作用。目前研究認為，結(jié)腸癌干細胞可能起源于正常成體腸隱窩干細胞。Asc12是一個堿性/螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，研究已證實其控制正常成體腸隱窩干細胞“命運”。Asc12在小鼠腸上皮中的轉(zhuǎn)基因過表達誘導了腸隱窩的過度增生和腸絨毛上的異位隱窩出現(xiàn)；Asc12基因在成體小鼠腸道的誘導缺失則導致Lgr5陽性的成體腸隱窩干細胞在數(shù)天后消失。并且

3、，近來研究發(fā)現(xiàn)，Asc12在人結(jié)腸癌標本中表達上調(diào)。因此，我們設想，Asc12可能與結(jié)腸癌干/前體細胞相關(guān)。盡管如此，Asc12在結(jié)腸癌干/前體細胞中的作用尚未知。因此，我們選擇了人結(jié)腸癌HT-29細胞(CD133陽性比例為47.5-95%)和LS174T細胞(CD133陽性比例為0.45%)來對Asc12在結(jié)腸癌干/前體細胞中的作用進行研究。
　　 研究方法及結(jié)果：
　　 免疫組織化學檢測證實Asc12在結(jié)腸腺癌中表達

4、增高，而在正常結(jié)腸組織中表達僅限于隱窩基底。Asc12干擾后，HT-29和LS174T細胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力均下降，同時干擾后的細胞裸鼠皮下成瘤能力也降低。Western-blot和細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)CD133陽性HT-29細胞中Asc12蛋白質(zhì)表達明顯高于CD133陰性HT-29細胞。流式細胞儀檢測進一步發(fā)現(xiàn)Asc12干擾后，HT-29細胞中CD133陽性細胞比例由54.7%下降到26.2%。與干細胞“干性”相關(guān)的

5、基因CD133、Sox2、Oct4、Lgr5、Bmil和C-myc在Asc12干擾后HT-29和LS174T細胞出現(xiàn)mRNA和蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)(LS174T細胞由于流式檢測CD133陽性細胞比例極低未檢測CD133表達情況)，在兩株細胞的裸鼠移植瘤中檢測這些“干性”相關(guān)基因也得到一致的結(jié)果。同時，Asc12干擾后HT-29細胞的成球能力也下降，表現(xiàn)為所形成的腫瘤球大小和數(shù)目均減少。miRNA芯片篩選出26種miRNA在Asc12干擾后

6、HT-29細胞中出現(xiàn)2倍以上的表達上調(diào)，而58種miRNA在Asc12干擾后HT-29細胞中出現(xiàn)2倍以上的表達下調(diào)。與干細胞“干性”相關(guān)的let-7b、miRNA-124、miRNA-125b、miRNA-17、miRNA-20a和miRNA-302b也包括在其中，并且行qPCR驗證進一步證實了其表達差異。我們對這些miRNA進行進一步研究發(fā)現(xiàn)，用miRNA-302b mimics在Asc12干擾后的HT-29細胞中恢復了miRNA-3