靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3小干擾RNA的構(gòu)建及其對(duì)結(jié)腸癌生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種新型有效的基因沉默技術(shù)，廣泛地應(yīng)用在腫瘤基因的研究中。許多研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是否與腫瘤的生長(zhǎng)增殖直接相關(guān)仍不清楚，本研究的目的在于通過(guò)構(gòu)建VEGFR-3 siRNA的表達(dá)載體來(lái)了解抑制VEGFR-3的表達(dá)是否可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的

2、生長(zhǎng)。
　　 方法：根據(jù)RNA干擾設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)3對(duì)包含有64bp的干擾片段，此片段有一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩端有和質(zhì)粒相接的粘性末端，和pSUPER載體相連接后雙酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建成pSUPER-siRNA/VEGFR-3重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，RT-實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)重組載體在轉(zhuǎn)染前后VEGFR-3 mRNA表達(dá)水平的變化，蛋白免疫印跡法(Weste

3、rn blot)檢測(cè)VEGFR-3的蛋白表達(dá)。通過(guò)篩選，將轉(zhuǎn)染高效表達(dá)VEGFR-3 siRNA的載體和空pSUPER載體的LoVo細(xì)胞注射入裸鼠皮下形成結(jié)腸癌腫瘤模型，定期測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)速度，腫瘤標(biāo)本免疫組織化學(xué)了解腫瘤VEGFR-3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定，靶向VEGFR-3的小干擾RNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，重組載體出現(xiàn)281bp的小片段，而空載體出現(xiàn)的則為241bp。將構(gòu)建的3條pSUPER-siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoV

4、o細(xì)胞系后，pSUPER-siRNA2/VEGFR-3重組載體可顯著抑制LoVo細(xì)胞中VEGFR-3基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染pSUPER-siRNA2/VEGFR-3細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，Western blot檢測(cè)顯示VEGFR-3基因蛋白表達(dá)明顯降低，與陰性對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)。將轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒后的腫瘤細(xì)胞和空載體細(xì)胞建造的裸鼠結(jié)腸癌腫瘤模型，見(jiàn)前者腫瘤增長(zhǎng)較后者明顯較慢，腫瘤體積在4周后測(cè)定對(duì)照組比對(duì)照組明顯小((201.4

5、±34.6)mm3 vs(439.6±31.9)mm3))。腫瘤組織VEGFR-3免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)前者的淋巴管形成較后者減少((4.8±3.9)mm3 vs(13.6±5.6)mm3)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：重組VEGFR-3 siRNA表達(dá)載體成功構(gòu)建，體外實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系血管內(nèi)皮生長(zhǎng)受體3形成基因沉默，并抑制胃癌細(xì)胞的增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，重組VEGFR-3 siRNA表達(dá)載體對(duì)結(jié)腸癌