RNA干擾沉默Survivin基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在國(guó)內(nèi)外都有較高的發(fā)病率。在美歐死亡率高居惡性腫瘤的第2位。我國(guó)已從第6位上升為第3位，。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和多種因素相關(guān)，其中細(xì)胞凋亡基因的突變起著重要作用。凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）在抑制細(xì)胞凋亡中有重要作用。Survivm是近年發(fā)現(xiàn)的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的IAPs家族的成員，在惡性腫瘤中具有較高的表達(dá)水平，并且和腫瘤的臨床病理分期、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移等具

2、有密切的關(guān)系，是目前已知的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。
　　 然而，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，Survivin不僅參與凋亡的抑制，還影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂以及轉(zhuǎn)移和侵襲等。但有關(guān)Survivin的研究觀點(diǎn)仍存在較多的分歧，如：有學(xué)者認(rèn)為Survivin在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)與腫瘤的治療效果和不良預(yù)后相關(guān)；而也有學(xué)者提出相反的觀點(diǎn)，在細(xì)胞質(zhì)中分布提示腫瘤預(yù)后良好。有學(xué)者認(rèn)為Survivin在G1/S期發(fā)揮作用，但也有認(rèn)為調(diào)控G2/M期。因此Survi

3、vin作用機(jī)制復(fù)雜，需要從整體水平深入探討Survivin調(diào)控機(jī)制。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)變化的特征，通過(guò)觀察干預(yù)前后組織細(xì)胞水平蛋白質(zhì)表達(dá)變化及差異，了解特定因素對(duì)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)影響，明確干預(yù)因素的作用機(jī)理。另外，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是可誘導(dǎo)目的基因同源mRNA降解阻斷特定基因的表達(dá)，具有高度特異性和高效性。本研究應(yīng)用RBAi技術(shù)，沉默Survivin基因的表達(dá)，

4、分析結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的變化；提取RNAi前后的細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究Survivin調(diào)控下的差異蛋白變化，尋找與Survivin功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。
　　 第一部分、 Survivin在結(jié)腸癌中的表達(dá)及分布
　　 目的：探討Survivin在結(jié)腸癌臨床標(biāo)本和細(xì)胞株中的表達(dá)及分布。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法研究Survivin在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及分布，明確Survivin

5、表達(dá)與腫瘤臨床特點(diǎn)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：在結(jié)腸癌臨床組織標(biāo)本中，Survivin陽(yáng)性表達(dá)率為57.6％，結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo、HCT116、SW480中均有Survivin表達(dá)。Survivin以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。Spearman相關(guān)分析顯示Survivin表達(dá)與腫瘤患者的臨床Ducks分期存在相關(guān)性。
　　 結(jié)論：在結(jié)腸癌臨床組織和細(xì)胞株中Survivin表達(dá)均較高，并以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主。Survivin與腫瘤的Ducks

6、分期具有相關(guān)性。
　　 第二部分、攜帶針對(duì)人Survivin的shRNA的腺病毒的轉(zhuǎn)染及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 目的：研究Survivin基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期和侵襲的影響。
　　 方法：擴(kuò)增、純化攜帶針對(duì)人Survivm的shRNA的增殖缺陷型腺病毒，利用流式細(xì)胞技術(shù)、RT-PCR、Western-bolt等檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的感染及基因抑制效果。針對(duì)Survivin基因沉默后的結(jié)腸癌細(xì)胞，

7、采用流式細(xì)胞儀、MTT、單克隆平板、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等，檢測(cè)Survivin基因在體外對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和侵襲的影響。另外研究Survivin基因體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 結(jié)果：增殖缺陷型腺病毒在MOI為50時(shí)，轉(zhuǎn)染率為92.67％，并具有明顯基因沉默作用。Survivin基因沉默后，凋亡率明顯增加，G1/S期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，細(xì)胞侵襲能力減弱，Survivin在體內(nèi)外均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　

8、　 結(jié)論：構(gòu)建的增殖缺陷型腺病毒具有較高的轉(zhuǎn)染率和基因沉默高效性，Survivin對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡、增殖、周期及侵襲有明顯的影響。
　　 第三部分、蛋白質(zhì)樣品制備、雙向電泳及圖譜分析
　　 目的：探討RNAi后的蛋白質(zhì)樣品制備、雙向電泳的條件及方法，為Survivin調(diào)控下差異蛋白的分析奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：免疫熒光分析Survivin在SW480中的分布；采用液氮凍融，RNase、DNase酶解及超聲裂解

9、等方法獲取蛋白質(zhì)樣品，在不同蛋白濃度和聚焦強(qiáng)度下進(jìn)行雙向電泳，采用硝酸銀染色并對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中，Survivin主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。液氮凍融，RNase、DNase酶解及超聲裂解等處理可明顯降低核酸的影響，促進(jìn)蛋白的溶解。250ug上樣量及70000Vh聚焦后，圖像分辨率和重復(fù)性均較好，在pI=4-8和Mr（15-120）×103分布的蛋白質(zhì)點(diǎn)較多，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1400個(gè)左右，超過(guò)80個(gè)蛋白

10、質(zhì)點(diǎn)存在明顯差異。
　　 結(jié)論：成功建立了分辨率及重復(fù)性均較好的雙向電泳圖譜。
　　 第四部分、差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及Survivin調(diào)控機(jī)制分析
　　 目的；對(duì)Survivin基因沉默前后的差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，探討Survivin在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制。
　　 方法：采用質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)信息檢索，明確與Survivin相互作用蛋白質(zhì)的變化；Western-bolt對(duì)興趣蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證；免疫沉淀檢測(cè)與