中山地區(qū)G6PD缺乏癥的分子流行病學(xué)調(diào)查及與腸道病毒71型手足口病的相關(guān)性研究.pdf

1、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD deficiency)是一種常見的X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，在全球范圍內(nèi)G6PD缺乏癥的患者有近4億人，約4.9％的人受累。現(xiàn)普遍認(rèn)為此病與瘧疾的自然選擇有關(guān)，主要分布在瘧疾曾一度流行的赤道附近熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國(guó)，這一遺傳性疾病主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，呈“南高北低”的趨勢(shì)，男性發(fā)病率高于女性。廣

2、東省是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，全省發(fā)病率約為3.1％～16.1％。上世紀(jì)的研究發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏癥是由基因突變所致。全球至今共報(bào)道186種G6PD基因突變類型，在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)28種，其中1376G＞T、1388G＞A和95A＞G是我國(guó)常見的三種突變，且僅在華人中存在。作為G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，我市至今尚未見G6PD缺乏癥基因頻率、基因突變譜及突變基因構(gòu)成比等遺傳學(xué)資料的研究。G6PD廣泛存在于人類體細(xì)胞內(nèi)，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，通過

3、提供還原型輔酶Ⅱ(Nitrate Reductase，NADPH)，使氧化型谷胱甘肽(Glutathione Disulfide，GSSG)轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH），保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足，細(xì)胞中GSH含量降低，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力不足。病毒感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激（Oxidative Stress），導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙[2-6]。研究發(fā)現(xiàn)，有限的抗氧化能力使

4、G6PD缺陷細(xì)胞對(duì)病毒的易感性增高，病毒感染G6PD缺陷細(xì)胞后會(huì)引起明顯的氧化應(yīng)激，該作用導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)，宿主細(xì)胞發(fā)生明顯的病理改變[7-9]。腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病(Hand，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD)的主要病原體之一，與手足口病患兒嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥密切相關(guān)。從以上研究出發(fā)，我們推測(cè)G6PD缺乏癥可能與EV71型手足口病有著密切關(guān)系，并可能通過氧化

5、應(yīng)激途徑影響EV71的易感性及致病性。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：中山地區(qū)G6PD缺乏癥的分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　 目的：G6PD缺乏癥是廣東省出生缺陷干預(yù)工程的五大病種之一，G6PD缺乏癥是中山市新生兒疾病篩查的病種之一，于1998年在我市開展，隨著篩查技術(shù)及篩查網(wǎng)絡(luò)的不斷完善，每年會(huì)檢出數(shù)千名G6PD缺乏癥患兒，作為G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，我市至今尚未見G6PD缺乏癥基因頻率、基因突變譜及突變基因構(gòu)成比等遺

6、傳學(xué)資料的研究，本課題的開展將填補(bǔ)中山地區(qū)在這方面的空白，揭示G6PD缺乏癥在本地區(qū)的分子流行病學(xué)特征。
　　 方法：在上世紀(jì)80年代，杜傳書進(jìn)行了大規(guī)模的G6PD缺乏癥流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示全國(guó)G6PD缺乏癥基因頻率為0～44.83％，其中廣東漢族為7.89％，廣東省總發(fā)病率為5.4％。通過以下公式n=[uα/2/arcsin(δ/√p(1-p))]2，P=0.054，允許誤差δ=0.01，α=0.05，進(jìn)行樣本量估計(jì)，至少需

7、要1961例。根據(jù)中山市政府2009年公布的中山市24個(gè)行政區(qū)（18個(gè)鎮(zhèn)區(qū)和6個(gè)街道）的人口比例，在2009年6月至2010年2月到我院接受婚前檢查的5940例中山市戶籍育齡人員中，按行政區(qū)人口比例進(jìn)行分層隨機(jī)抽樣，共抽取樣本4105例，其中男性2119例，女性1986例，被檢者就診時(shí)均無(wú)貧血表現(xiàn)，所有研究對(duì)象均在我院的婚檢篩查系統(tǒng)建立個(gè)人檔案，課題全程采用電子化信息管理。本研究建立了從表型到基因型的分子鑒定流程，用Victor2-14

8、20型多標(biāo)記分析儀定量檢測(cè)樣品中G6PD活性，成人G6PD活性＜1300U/L則為陽(yáng)性，對(duì)陽(yáng)性樣品用酚-氯仿法提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后利用變性高效液相色譜(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)技術(shù)進(jìn)行分析，經(jīng)DHPLC技術(shù)未檢測(cè)出已知基因突變且表型陽(yáng)性的樣品被送去上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行G6PD基因測(cè)序。
　　 結(jié)果：本次流行病學(xué)調(diào)查共檢出G6

9、PD缺乏者195例，其中男性134例，男性檢出率為6.32％，女性61例，女性檢出率為3.07％，總檢出率為4.75％，男性和女性的G6PD缺乏癥檢出率有顯著差異(X2=23.97，P＜0.001)，男性高于女性，根據(jù)Hardy-Weinbeng定律，X連鎖疾病人群發(fā)病率等于男性患者頻率，中山市G6PD缺乏癥基因頻率為6.32％。我們從以上195例樣品中鑒定出191例有基因突變，4例表型陽(yáng)性樣品未檢出突變，其中173例通過DHPLC分析

10、，18例通過基因測(cè)序，共檢出10種變異類型，分別為1388G＞A、1376G＞T、95A＞G、871G＞A、1311C＞T、1024C＞T、517C＞T、592C＞T、392G＞T、196T＞A，其中1376G＞T,1388G＞A以及95A＞G共占76.92％，本次在中山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的517C＞T、196 T＞A均為廣東地區(qū)首次報(bào)道。從本次調(diào)查中我們還發(fā)現(xiàn)，1388G＞A、1376G＞T和95A＞G這三種基因突變對(duì)應(yīng)G6PD酶的活性水平無(wú)顯

11、著差異，但半合子的G6PD酶活性明顯低于雜合子。
　　 結(jié)論：通過本次流行病學(xué)調(diào)查，闡明了中山戶籍人群G6PD缺乏癥的發(fā)病率、基因突變譜及表型與基因型的關(guān)系，為制訂該地區(qū)G6PD缺乏癥的防控計(jì)劃提供科學(xué)的參考依據(jù)，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)有重要意義。
　　 第二部分：G6PD缺乏癥與腸道病毒71型手足口病的相關(guān)性研究。
　　 目的：腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病的主要病

12、原體之一，與重癥手足口病密切相關(guān)。病毒感染機(jī)體后可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激并進(jìn)一步加重感染。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足，細(xì)胞中GSH含量降低，機(jī)體抗氧化能力不足。近年來(lái)已有研究發(fā)現(xiàn)G6PD缺陷細(xì)胞對(duì)EV71易感，我們推測(cè)G6PD缺乏癥可能與EV71感染所致手足口病有著密切關(guān)系。目前G6PD缺陷與EV71型手足口病關(guān)系的研究報(bào)道尚少，本次研究旨在探討G6PD缺陷對(duì)手足口病患兒EV71病毒易感性、感染后病情嚴(yán)重程度的影響，闡明G6PD

13、缺乏癥與EV71型手足口病之間的關(guān)系。
　　 方法：鑒于目前常見的G6PD活性檢測(cè)方法對(duì)男性缺乏者敏感，對(duì)女性缺乏者存在明顯的漏檢，故本次研究以男性兒童為研究對(duì)象。選取2011年6月至2012年10月我院收治的手足口病男性患兒220例為研究對(duì)象，其中145例為普通手足口?。ㄆ胀ńM），75例為重癥手足口病（重癥組）。手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照我國(guó)衛(wèi)生部2010年4月21日發(fā)布的《手足口病診療指南（2010年版）》。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)

14、滿足以下3個(gè)條件:①符合手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn);②經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)大便病原學(xué)診斷為EV71感染;③病程少于5天。排除標(biāo)準(zhǔn)為以下任一項(xiàng)者:①近3個(gè)月內(nèi)曾輸血、溶血;②家長(zhǎng)拒絕行G6PD活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)。對(duì)照組同期在我院體檢的132例健康男性兒童。所有研究對(duì)象在收住院后24小時(shí)內(nèi)及手足口病恢復(fù)期分別采集靜脈血用于檢測(cè)血液中G6PD、GSH及MDA水平。根據(jù)急性期G6PD活性測(cè)定結(jié)果，

15、普通組與重癥組分別分為普通（G6PD正常）組、普通（G6PD缺乏）組、重癥（G6PD正常）組與重癥（G6PD缺乏）組。220例患兒均按照《指南》給予治療，觀察記錄重癥組患兒的總熱程、精神異常時(shí)間、肢體抖動(dòng)持續(xù)時(shí)間、病理征持續(xù)時(shí)間及住院天數(shù)。
　　 結(jié)果：⑴對(duì)照組、普通組、重癥組中G6PD缺陷者分別為4例、15例、17例，所占比例分別為3.0％、10.34％、22.67％，普通組、重癥組G6PD缺陷率均較對(duì)照組高（均P＜0.05）

16、。⑵重癥（G6PD缺乏）組患兒總熱程為6.35±2.15天，精神異常天數(shù)為2.65±0.93天，肢體抖動(dòng)持續(xù)天數(shù)為3.09±1.03天，病理征持續(xù)時(shí)間為1.18±0.53天，住院天數(shù)為10.59±2.32天，G6PD活性為524.26±450.61U/L;重癥（G6PD正常）組患兒總熱程為5.37±1.36天，精神異常天數(shù)為1.81±1.62天，肢體抖動(dòng)持續(xù)天數(shù)為2.41±1.19天，病理征持續(xù)時(shí)間為0.66±0.86天，住院天數(shù)為8.

17、74±3.04天，G6PD活性為2842.67±665.64U/L。G6PD缺陷患兒總熱程、精神異常天數(shù)、肢體抖動(dòng)持續(xù)天數(shù)、病理征持續(xù)天數(shù)及住院天數(shù)均顯著長(zhǎng)于G6PD正常者(P＜0.05)，G6PD缺乏癥患兒G6PD活性較G6PD活性正常者顯著降低(P＜0.001)。⑶普通組急性期全血GSH含量為2.70±0.98mg/gHb，血清MDA為3.80±1.10umol/L，G6PD活性為2963.06±988.36 U/L;重癥組急性期全

18、血GSH含量為2.28±1.51mg/gHb，血清MDA為4.19±1.08umol/L，G6PD活性為2317.16±1157.63U/L;對(duì)照組全血GSH含量為3.63±0.65mg/gHb，血清MDA為3.41±0.52umol/L，G6PD活性為3260.26±701.83U/L。急性期普通組和重癥組的GSH、G6PD水平均顯著低于對(duì)照組，MDA水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);重癥組的GSH、G6PD水平均顯著低于普通組，

19、MDA水平顯著高于普通組(P＜0.05)。普通組恢復(fù)期全血GSH含量為2.63±0.83mg/gHb，血清MDA為3.76±1.09umol/L，G6PD活性為2984.11±972.82 U/L;重癥組恢復(fù)期全血GSH含量為2.41±0.91mg/gHb，血清MDA為3.99±0.91umol/L，G6PD活性為2324.77±1148.04U/L?；謴?fù)期普通組與重癥組GSH、G6PD水平均比對(duì)照組低(P＜0.05)，MDA水平均較對(duì)

20、照組高(P＜0.05);普通組與重癥組恢復(fù)期GSH、MDA水平比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，普通組G6PD水平仍顯著高于重癥組(P＜0.05)。⑷普通(G6PD正常)組急性期的全血GSH為2.92±0.76mg/gHb，血清MDA為3.62±1.01 umol/L，G6PD活性為3242.85±549.26U/L;普通(G6PD正常)組恢復(fù)期的全血GSH為2.81±0.48mg/gHb，血清MDA為3.71±1.57 umol/L，

21、G6PD活性為3265.18±574.45 U/L;普通(G6PD缺乏)組急性期的全血GSH為0.77±0.12mg/gHb，血清MDA為5.37±0.41umol/L，G6PD活性為538.22±490.94U/L;普通(G6PD缺乏)組恢復(fù)期的全血GSH為1.08±0.20mg/gHb，血清MDA為4.14±1.19umol/L，G6PD活性為548.18±484.10U/L;重癥(G6PD正常)組急性期的全血GSH為2.75±0.

22、84mg/gHb，血清MDA為3.80±0.84umol/L，G6PD活性為2842.67±665.64 U/L;重癥(G6PD正常)組恢復(fù)期的全血GSH為2.78±0.78mg/gHb，血清MDA為3.92±1.14umol/L，G6PD活性為2849.58±665.91U/L;重癥(G6PD缺乏)組急性期的全血GSH為0.67±0.13mg/gHb，血清MDA為5.53±0.67umol/L，G6PD活性為524.26±450.61

23、U/L;重癥(G6PD缺乏)組恢復(fù)期的全血GSH為1.16±0.26mg/gHb，血清MDA為4.24±1.00umol/L，G6PD活性為534.26±440.35U/L。急性期及恢復(fù)期普通（G6PD正常）組GSH水平均較普通（G6PD缺乏）組高(P＜0.01)，重癥（G6PD正常）組GSH水平均較重癥（G6PD缺乏）組高(P＜0.01)。急性期普通（G6PD正常）組MDA水平較普通（G6PD缺乏）組低(P＜0.01)，重癥（G6PD

24、正常）組MDA水平較重癥（G6PD缺乏）組低(P＜0.01)。在恢復(fù)期，普通（G6PD正常）組與普通(G6PD缺乏)組、重癥（G6PD正常）組與重癥（G6PD缺乏）組MDA水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。普通（G6PD正常）組、重癥（G6PD正常）組急性期與恢復(fù)期GSH、MDA水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），普通(G6PD缺乏)、重癥（G6PD缺乏）組恢復(fù)期GSH水平均較急性期高(P＜0.01)，恢復(fù)期MDA水平

25、均較急性期低(P＜0.01)。以上四組急性期與恢復(fù)期G6PD水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。⑸急性期普通組GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.001），MDA與G6PD活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.51，P＜0.001)。急性期重癥組GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)（r=0.53，P＜0.001），MDA與G6PD活性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57，P＜0.001）。恢復(fù)期普通組GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)（r=

26、0.65，P＜0.001），重癥組GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)（r=0.48，P＜0.001），普通組和重癥組MDA與G6PD活性均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：從研究結(jié)果可知普通組、重癥組G6PD缺陷者所占比例均高于對(duì)照組，提示G6PD缺乏可能增加機(jī)體對(duì)EV71的易感性。本研究中，急性期普通組與重癥組GSH、G6PD水平比對(duì)照組低，MDA水平較對(duì)照組高，提示在EV71感染急性期，機(jī)體確實(shí)存在氧化應(yīng)激。進(jìn)一步分析發(fā)

27、現(xiàn)，手足口病患兒GSH、MDA水平均受G6PD活性影響，GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)，MDA水平與G6PD活性呈負(fù)相關(guān)，以上結(jié)果提示G6PD缺陷者在EV71感染急性期，由于抗氧化能力不足，可能會(huì)出現(xiàn)高水平氧化應(yīng)激，加重氧化應(yīng)激損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)重癥組中G6PD缺陷者病情好轉(zhuǎn)需時(shí)及住院時(shí)間均較G6PD活性正常者長(zhǎng)，提示機(jī)體氧化應(yīng)激的程度與患兒病情相符。本研究中，G6PD缺陷患兒恢復(fù)期GSH水平較急性期增高，MDA水平較急性期降低，且恢

28、復(fù)期GSH水平與G6PD活性呈正相關(guān)，MDA水平與G6PD活性無(wú)相關(guān)性，以上結(jié)果提示G6PD缺陷患兒進(jìn)入手足口病恢復(fù)期后，隨著氧化應(yīng)激損傷的減輕，患兒的病情可能隨之好轉(zhuǎn)。手足口病患兒急性期與恢復(fù)期G6PD水平比較均無(wú)顯著差異，說(shuō)明說(shuō)明G6PD缺陷不因EV71感染而改變，G6PD活性不受EV71感染影響。EV71感染引起重癥手足口病的致病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未清楚，本次研究結(jié)果在臨床上提示機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是機(jī)制之一。廣東省于1989年

29、開始在新生兒中逐步開展G6PD缺乏癥篩查，2003年廣東省衛(wèi)生廳制定了《廣東省新生兒疾病篩查管理辦法》（試行），明確指出G6PD缺乏癥為廣東省新生兒疾病篩查的病種之一。鑒于本次研究結(jié)果，對(duì)確診為G6PD缺乏癥的患兒，除了告知避免接觸誘發(fā)溶血的物質(zhì)，還需告知其對(duì)病毒易感，在手足口病流行季節(jié)注意加強(qiáng)防護(hù)。檢測(cè)手足口病患兒G6PD活性，確定其是否存在G6PD缺陷，有助于評(píng)估患兒病情轉(zhuǎn)歸，警惕發(fā)展為重癥病例，對(duì)指導(dǎo)臨床診療、觀察病情和判斷預(yù)后具