靈芝深層發(fā)酵水溶性活性物質(zhì)的研究.pdf

1、本論文主要對靈芝深層發(fā)酵蛋白酶A抑制劑的分離純化、基本特性、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、產(chǎn)生的基本條件、純生啤酒中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究。 靈芝深層發(fā)酵水溶性活性物質(zhì)初步分離研究發(fā)現(xiàn)：靈芝深層發(fā)酵也能產(chǎn)生SOD，且菌絲體中的含量明顯高于發(fā)酵液，4℃半衰期為7d，相對表觀分子量為35000。 靈芝發(fā)酵全粉抽提液中分離得兩種蛋白酶A抑制劑GLPIA1和GLPIA2，建立的純化工藝為：乙醇分級沉淀(30～80％)、UltrogelAcA

2、44凝膠層析、Source30Q離子交換層析。 SDS-PAGE和凝膠過濾測定GLPIA1相對表觀分子量為38000；GLPIA1的熱穩(wěn)定性較高，80℃保溫30分鐘，仍保留95％以上的活性，98℃也僅丟失約9％的抑制活性；GLPIA1的pH穩(wěn)定范圍為3.0～7.5；GLPIA1對幾種蛋白酶都表現(xiàn)出一定的抑制作用，且對兩種天冬氨酸族蛋白酶有相對較高的抑制活性；GLPIA1對蛋白酶A作用時，Ki值為2.2×10-6，抑制效果最強(qiáng)，其

3、次是胃蛋白酶，GLPIA1對蛋白酶A的IC50為0.16mg/ml；動力學(xué)研究(Lineweaver-Burk作圖法)發(fā)現(xiàn)，GLPIA1是蛋白酶A的非競爭性抑制劑。蛋白酶A抑制劑被兩種蛋白酶協(xié)同水解或被β-1，3葡聚糖酶水解后，抑制作用都出現(xiàn)大幅度的下降，說明GLPAI1肽鏈或糖鏈部分發(fā)生降解對其抑制活性有較大影響；GLPIA1中亞氨基酸(脯氨酸)和酸性氨基酸的含量相對較多(分別接近11％和27％)；氣相色譜分析GLPIA1糖鏈組成中含

4、有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖四種單糖，其中葡萄糖的含量為96％；β-消去反應(yīng)前后的紫外掃描和氨基酸組成比較結(jié)果表明：GLPIA1中的糖苷鍵為O型糖苷鍵。 GLPIA1的紅外吸收圖譜及核磁共振圖譜結(jié)果說明：GLPIA1是一個典型的多糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，多糖中含有β糖苷鍵；GLPIA1側(cè)鏈存在少量β1，6-糖苷鍵，結(jié)合紅外與氣相的結(jié)果，推測此糖蛋白的糖鏈主要由β-D-葡萄糖以β-1，3糖苷鍵相連，存在極少量的分支，分支點(diǎn)為β1

5、，6-糖苷鍵。 據(jù)GLPIA1與剛果紅復(fù)合物及單純剛果紅溶液在不同NaOH濃度下λmax的變化，得出GLPIA1分子存在三股螺旋構(gòu)象；不同濃度堿處理又中和透析過的GLPIA1在不同濃度下進(jìn)行蛋白酶A抑制活性分析，抑制活性的變化與糖鏈構(gòu)象變化相對應(yīng)，證實(shí)GLPIA1空間結(jié)構(gòu)與其抑制活性存在密切關(guān)系。 靈芝發(fā)酵全粉抽提液中另一種蛋白酶抑制劑GLPIA2，僅在215有紫外吸收；GLPIA2的酸性氨基酸較高，三種芳香族氨基酸Tr

6、p，Phe和Tyr的含量很低。SDS-PAGE測定其相對表觀分子量為15000；GLPIA2對胃蛋白酶和酵母蛋白酶A的抑制作用相對較強(qiáng)，比抑制活力分別為14.96u/mg與10.84u/mg；抑制劑對胃蛋白酶和蛋白酶A的Ki分別為1.52×10-7mol/L和1.34×10-6mol/L；GLPIA2對胃蛋白酶的半抑制濃度IC50值為0.18mg/ml，對蛋白酶A的半抑制濃度IC50值0.29mg/ml；GLPIA2是胃蛋白酶和蛋白酶A

7、的競爭性抑制劑。 不同發(fā)酵周期和不同干燥條件下研究靈芝深層發(fā)酵液中蛋白質(zhì)抑制劑的產(chǎn)生規(guī)律，結(jié)果表明：在pH7～9條件下干燥對蛋白酶抑制劑活性的產(chǎn)生有利。 蛋白酶A抑制劑的應(yīng)用結(jié)果表明：純生啤酒中適量添加蛋白酶A抑制劑，可在不改變純生啤酒其它特性的前提下，較好地提高純生啤酒泡沫穩(wěn)定性。 靈芝真菌的深層發(fā)酵能產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)，本研究首次發(fā)現(xiàn)其中的一些蛋白酶A抑制劑，不僅在提高純生啤酒泡沫穩(wěn)定性上很有應(yīng)用潛力，而且