桑黃深層發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究.pdf

1、桑黃，俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等，是一種大型珍稀藥用真菌，現(xiàn)代藥理研究表明桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強(qiáng)免疫等作用。目前大多研究以桑黃野生子實(shí)體多糖及蛋白聚糖為主，而對(duì)其所含的類黃酮等其它成分研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，桑黃菌絲體含有與子實(shí)體相似的活性成分，采用深層發(fā)酵培養(yǎng)桑黃菌絲體提取活性物質(zhì)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，材料易得、生產(chǎn)成本低，因而利用液體深層發(fā)酵是開(kāi)發(fā)桑黃藥用價(jià)值的又一新途徑。本研究對(duì)收集到的桑黃菌株進(jìn)行鑒定、篩選，并

2、對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化以期獲得最佳發(fā)酵條件為規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，同時(shí)對(duì)獲得的桑黃菌絲體提取物進(jìn)行了活性試驗(yàn)，為深層發(fā)酵生產(chǎn)活性物質(zhì)提供理論支持。 本論文共分三部分，分別研究了菌株的鑒定、篩選、桑黃深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌絲體提取物體外生物活性等，主要結(jié)果如下： 1.菌耕鑒定及優(yōu)良菌株的篩選 對(duì)收集到的PB-10、PI-12、MYSH和NFSH四菌株進(jìn)行了ITS序列比對(duì)分析，結(jié)合拮抗試驗(yàn)結(jié)果，將PB

3、-10、PI-12、MYSH和NFSH四菌株依次歸屬為Phellinus baumii，Phellinus baumii，Phellinus linteus，Phellinus badius。以菌絲生長(zhǎng)速度、生物量、菌絲總黃酮含量、多糖含量為主要試驗(yàn)指標(biāo)對(duì)四菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果表明PB-10菌株各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)分別達(dá)5.10mm/d、1.18g/100mL、2.1％、55.83mg/100mL，遠(yuǎn)高于或于其它試驗(yàn)菌株相近。各菌株菌絲體提取物抗

4、氧化、抑制小鼠L1210細(xì)胞增殖、刺激淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明：PB-10菌株菌絲體乙醇提取物清除活性氧能力大大強(qiáng)于其它試驗(yàn)菌株，在250μg/mL下對(duì)L1210細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)82％，高于其它試驗(yàn)菌株，菌絲體粗多糖刺激淋巴細(xì)胞增殖能力亦強(qiáng)于其它試驗(yàn)菌株。PB-10 菌株適宜作為桑黃產(chǎn)黃酮或多糖發(fā)酵試驗(yàn)用菌株。 2.桑黃PB-10菌株深層發(fā)酵條件的優(yōu)化 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)因子及非營(yíng)養(yǎng)因子單因素、正交試驗(yàn)，分別確定了PB-10菌株深層

5、發(fā)酵生產(chǎn)多糖、黃酮的最佳培養(yǎng)條件。 產(chǎn)黃酮最優(yōu)培養(yǎng)條件為：葡萄糖10g/L，玉米粉40g/L，豆餅粉5g/L，KH<,2>PO<,4> 3g/L，MgSO<,4> 1.5g/L；培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，pH值自然，接種量8～10％，裝液量100mL (250mL，三角瓶)，發(fā)酵周期144hrs，在此條件下粗黃酮產(chǎn)量達(dá)26.25mg/100mL。產(chǎn)多糖最優(yōu)培養(yǎng)條件為：葡萄糖5g/L，玉米粉40g/L，豆餅粉20g

6、/L，KH<,2>PO<,4>1.5g/L，MgSO<,4> 1g/L；培養(yǎng)溫度28℃，搖瓶轉(zhuǎn)速140r/min，pH值自然，接種量10％，裝液量100mL(250mL三角瓶)，發(fā)酵周期132brs；此條件下多糖產(chǎn)量可達(dá)118.5mg/100mL。 對(duì)產(chǎn)黃酮、多糖培養(yǎng)條件的綜合分析表明：葡萄糖5～10g/L，玉米粉40g/L，豆餅粉5～20g/L，KH<,2>PO<,4> 1.5～3g/L，MgSO<,4> 1～1.5g/L。最

7、適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速140～160 r/min，pH值自然，接種量8～10％，裝液量100 mL(250mL 三角瓶)，發(fā)酵周期132～144hrs；在此條件下獲得黃酮的同時(shí)得到大量多糖是可能的。 3.菌絲體提取物體外活性試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)發(fā)酵不同階段菌絲體乙醇提取物及發(fā)酵菌絲體乙醇提取物不同溶劑萃取組分進(jìn)行活性氧清除試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)各供試樣品均有清除活性氧能力，且清除能力與其總黃酮含量之間存在明顯正相關(guān)性。發(fā)