放線菌產(chǎn)生物防腐物質(zhì)的發(fā)酵條件和結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、隨著人們對食品安全要求的提高，研究開發(fā)新型食品生物防腐劑并將其應(yīng)用于食品工業(yè)可以滿足人們對食品安全的迫切需求，具有廣闊的發(fā)展前景。土壤放線菌的物種和代謝產(chǎn)物多樣性極為豐富，因其產(chǎn)生獨特次生代謝產(chǎn)物而備受世界的關(guān)注，具有重大的學(xué)術(shù)價值和商業(yè)價值。篩選具有明顯抑菌作用的食品生物防腐物質(zhì)，對于保障食品安全和提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。廣州地處亞熱帶，在我國是具有生態(tài)系統(tǒng)多樣性、生物基因多樣性和生物種類多樣性極其豐富的地區(qū)，蘊藏著數(shù)量龐大的放線菌

2、資源，具有巨大的開發(fā)和利用潛力。因此，具抑菌活性土壤放線菌的開發(fā)利用一直受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。
　　本研究在廣州及其周邊共11個樣地點采集土壤樣品64份，采用平板稀釋法分離，總共分離得到放線菌190株。分離結(jié)果顯示，菜園土中分離出來的放線菌量最多、多樣性最豐富，其次是果園土和森林土，路邊土和沙河土分離出的放線菌最少、多樣性最差。表明放線菌數(shù)量和多樣性情況與土壤中有機質(zhì)含量有關(guān)。通過抑菌試驗篩選分離得到的放線菌。初篩采用瓊脂塊法，選

3、擇5種指示菌進行抑菌試驗，共得到134株具有抑菌活性的菌株。通過復(fù)篩，最終確定7株具有強抑菌活性菌株為優(yōu)良菌株，并選擇7種指示菌，進一步驗證優(yōu)良菌株的抑菌活性。通過2株優(yōu)良菌株的16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)良菌株與鏈霉菌屬(Streptomyces)的多個種相似性達到99％以上，菌株P(guān)Y-C-21與毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）在同一個分支上，菌株ZC-G-5與小白鏈霉菌（Streptomyces

4、albulus）在同一個分支上，可見他們具有同源性且親緣關(guān)系較近，再結(jié)合形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特性觀察和生理生化試驗結(jié)果表明該2株優(yōu)良菌株與相關(guān)近緣菌株基本相似，因此，確定菌株P(guān)Y-C-21為毒三素鏈霉菌，菌株ZC-G-5為小白鏈霉菌。在優(yōu)良菌株發(fā)酵條件優(yōu)化中，通過單因素試驗，在高氏一號培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基的發(fā)酵基礎(chǔ)上，確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源和最佳氮源分別為淀粉和硝酸鉀，菌株的最佳發(fā)酵時間為7d，最佳發(fā)酵pH為7，最佳接種量為10％，

5、最佳裝液量為30mL（100mL錐形瓶的發(fā)酵容量），最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速為160r/min，最佳發(fā)酵溫度為28℃。進行活性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定，首先制備菌株P(guān)Y-C-21的發(fā)酵產(chǎn)物，通過乙酸乙酯和二氯甲烷萃取得到粗提取物，再采用硅膠柱層析進一步提純粗產(chǎn)物，通過高效液相色譜、薄層色譜分析和制備色譜制備純品化合物。最終通過高效液相色譜、氣質(zhì)比對、高分辨質(zhì)譜分析，將具有抑菌活性的單體化合物分別鑒定為鄰苯二甲酸二丁酯、苯甲酸、2，2'-亞甲基雙（5-甲基-6