納米鉆石靶向載藥體系的制備及其與細(xì)胞相互作用的研究.pdf

1、由于環(huán)境污染日益嚴(yán)重和人們不良的生活習(xí)慣,導(dǎo)致癌癥的高發(fā)病率,以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于癌癥治療的低效,導(dǎo)致其高的死亡率。在傳統(tǒng)的癌癥治療方法中,化學(xué)療法被認(rèn)為是最簡(jiǎn)便有效的方法之一。但是由于癌癥確診較晚,以及抗癌藥物多為小分子化合物,血液給藥后快速擴(kuò)散,分布于全身,在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)分裂較快的正常細(xì)胞有較大的毒副作用,且多次給藥后腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生多藥耐藥性,特別是固態(tài)腫瘤,從而導(dǎo)致化療的失敗。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米醫(yī)藥為腫瘤的診斷和治療提

2、供了新的思路。納米技術(shù)在影像醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用可提高其檢測(cè)靈敏度,如磁共振成像技術(shù)、超聲成像技術(shù)及X-射線計(jì)算斷層攝影技術(shù)等,近期隨著活體成像技術(shù)和多光子激發(fā)掃描技術(shù)等的發(fā)展,推動(dòng)了熒光成像在腫瘤診斷中的應(yīng)用,這些新技術(shù)的發(fā)展使腫瘤的早期確診成為可能。此外利用腫瘤新生血管的不完整結(jié)構(gòu)導(dǎo)致納米顆粒在腫瘤附近的高透過高滯留效應(yīng),可將抗癌藥物制備成納米藥物或裝載在納米載體上可達(dá)到被動(dòng)靶向治療腫瘤的效果,進(jìn)一步在納米顆粒表面修飾一些與腫瘤細(xì)胞或新

3、生血管具有特異性結(jié)合的配體,得到主動(dòng)靶向到腫瘤的目的,即靶向輸送藥物體系。該體系可以降低抗癌藥物的用量和毒副作用,同時(shí)也可抑制腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性,提高治療效率?，F(xiàn)研究的納米載體材料主要有脂質(zhì)體、高分子聚合物、碳納米管、膠束、納米微球及一些天然高分子化合物等。最近,具有生物相容性好、光學(xué)與化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、合成技術(shù)成熟和表面易于修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)的納米鉆石在生物領(lǐng)域的應(yīng)用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),以納米鉆石作為藥物載體和熒光成像試劑還處于研究初期。<

4、br>　　本論文以爆炸合成的納米鉆石(ND)作為載體材料,聚乙二醇(PEG)作為交聯(lián)劑,轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)為靶向分子,對(duì)ND進(jìn)行修飾制備得到靶向腫瘤細(xì)胞的納米載體。以阿霉素(DOX)為藥物模型,正常人肝細(xì)胞(L-02細(xì)胞)和肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)為細(xì)胞模型,對(duì)納米載藥體系與細(xì)胞的相互作用和載藥體系在細(xì)胞內(nèi)的藥物緩釋及靶向性進(jìn)行了研究。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.使用電導(dǎo)返滴定法對(duì)強(qiáng)酸氧化處理后的ND表面羧酸含量進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算得到

5、每個(gè)粒徑為~140nm的ND粒子表面含有3.36×105個(gè)羧基。
　　2.對(duì)ND物理吸附行為進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,Cit3-可以加強(qiáng)ND對(duì)DOX的吸附,同時(shí)驗(yàn)證了Cl-可以調(diào)控DOX從ND上的解離;對(duì)Tf的吸附行為符合Langmuir等溫吸附,在PBS(pH7.4)中最大吸附量為(176.46±2.13)μg/mg,在pH(5.5)等于Tf的等電點(diǎn)附近有最大吸附,可能是因?yàn)門f在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小,與ND的疏水作用力增大,吸附能力

6、增強(qiáng)。利用激光共聚焦和流式細(xì)胞儀對(duì)ND和ND-Tf內(nèi)吞到HepG2細(xì)胞的差異進(jìn)行了定性和定量分析,結(jié)果得到ND-Tf比ND容易內(nèi)吞到細(xì)胞中,利于可發(fā)熒光的ND在胞內(nèi)成像。
　　3.對(duì)ND進(jìn)行PEG修飾后可提高其分散性,利于細(xì)胞內(nèi)吞。對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-DOX納米載藥體系進(jìn)行了研究,證明HepG2細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-DOX的速率比游離DOX慢2倍,但是進(jìn)入細(xì)胞的DOX量明顯比游離的DOX內(nèi)吞量增加,并降低了DOX的細(xì)胞毒性。使

7、用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-DOX后胞內(nèi)ND的熒光強(qiáng)度與側(cè)向角的變化呈一致的趨勢(shì),故可以使用側(cè)向角的變化來判斷細(xì)胞內(nèi)吞納米顆粒的量。使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-DOX的過程,表明FND-PEG-DOX對(duì)DOX具有緩釋效應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-DOX的機(jī)理為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程,與DOX的自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)理不同。
　　4.以Tf為靶向分子,成功構(gòu)建了ND-PEG-Tf納米靶向藥物載體,使用流式細(xì)胞

8、儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ND的熒光強(qiáng)度表明細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-Tf是時(shí)間和濃度依賴的。細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-Tf的量與細(xì)胞表面表達(dá)TfR的量密切相關(guān),利用Fe3+存在下游離Tf的抑制試驗(yàn)證明細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-Tf是由TfR介導(dǎo)的。依據(jù)高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞和低表達(dá)TfR的正常細(xì)胞差異,ND-PEG-Tf可選擇性的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,靶向輸送藥物。使用MTT法對(duì)ND-PEG-Tf-DOX納米載藥體系的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明ND-PEG-Tf-D

9、OX對(duì)TfR表達(dá)較高的腫瘤細(xì)胞具有較大的細(xì)胞毒性,而與游離DOX的細(xì)胞毒性相比,ND-PEG-Tf-DOX可減小對(duì)TfR表達(dá)較低的正常細(xì)胞的毒性,即減小DOX的毒副作用。因此ND-PEG-Tf作為靶向藥物輸送載體對(duì)腫瘤的治療具有潛在的應(yīng)用。
　　5.對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)吞N(yùn)D-PEG-Tf納米顆粒后的生長(zhǎng)曲線證明ND-PEG-Tf不影響細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)使用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡測(cè)定得到細(xì)胞內(nèi)的ND-PEG-Tf會(huì)隨細(xì)胞分裂將其