KLF5介導高磷誘導的Runx2表達和血管平滑肌細胞成骨樣分化.pdf

1、血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、慢性腎臟病的主要并發(fā)癥。血管鈣化導致血管彈性和血管順應性降低，使血管疾病突發(fā)事件增加，如心肌梗死，動脈粥樣硬化斑塊破裂等。很多因素，如礦物質代謝紊亂，慢性炎癥，氧化應激等等和血管鈣化的形成有關。越來越多的證據表明，血管鈣化并非簡單的鈣磷被動沉積，而是受到精細調控的類似骨的骨化過程。其中包括血管平滑肌細胞(vascular smooth cell，VSMC)向成骨樣細胞轉化。體外和活體實驗表明，在高

2、磷刺激下，VSMC中骨相關蛋白，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、基質Gla蛋白(matrix Glaprotein，MGP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，骨鈣素(osteocalcin，OC)等表達增加，同時VSMC分化標志基因平滑肌肌動蛋白α(smooth muscleα-actin，SMα-actin)和平滑肌22α(smooth muscle22α，SM22α)表達減少。
　

3、　最近研究顯示，在動脈粥樣硬化患者的血管鈣化組織和小鼠鈣化的VSMC中檢測到Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor2，Runx2，調節(jié)成骨和軟骨分化的關鍵轉錄因子）的表達，而正常血管中沒有檢出。Runx2缺失能夠抑制氧化應激誘導的VSMC標志基因的下調，降低成骨樣細胞的形成。血管緊張素2通過激活Runx2和NF-κB加劇血管鈣化，表明Runx2在血管鈣化中具有關鍵作用。
　　調控

4、VSMC表型轉變的轉錄因子也和血管鈣化的發(fā)生發(fā)展有關。如高磷能夠誘導Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor4，KLF4）的表達，KLF4敲低則可以減輕高磷誘導的VSMC向成骨樣細胞轉化，降低成骨標志基因的表達和鈣沉積。KLF4在腺嘌呤誘導的尿毒癥大鼠的鈣化的主動脈中表達量也增加。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）通過激活Krüppel樣因子5(Krüppel-like f

5、actor5，KLF5)（促增殖轉錄因子）抑制p21的表達，促進VSMC向合成型細胞轉化。KLF4和KLF5是KLF家族中緊密相關的轉錄因子，分別從正向和反向調節(jié)細胞增殖。然而，KLF5在VSMC鈣化中是否發(fā)揮作用還不清楚。此外，KLF5和Runx2介導的VSMC鈣化之間的內在關系也有待探討。本文的目的是闡明KLF5在VSMC鈣化中的作用，明確KLF5和Runx2在調制VSMC鈣化中的相互關系。
　　第一部分高磷促進血管平滑肌細胞

6、的成骨樣分化和KLF5的表達
　　目的:探討高磷誘導VSMC鈣化與KLF5表達的關系。
　　方法:以3.8mM無機磷處理大鼠VSMC，建立鈣化模型。通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)鈣化結節(jié)、ALP活性升高、鈣離子含量測定以確定VSMC成骨樣轉化。以real-time PCR和Western blotting檢測KLF5、成骨標志基因Runx2、VSMC標志基因SMα-actin和SM22α表達。應用離體血管環(huán)驗證高磷誘導的VSMC鈣化及各

7、基因的表達變化。
　　結果:茜素紅染色顯示，VSMC在3.8mM無機磷誘導下，出現(xiàn)明顯的鈣化結節(jié)，堿性磷酸酶活性增強，鈣離子含量增加，提示大鼠VSMC發(fā)生鈣化。血管環(huán)實驗Von kossa染色顯示，鈣化組出現(xiàn)明顯的黑色鈣沉積。細胞和離體血管環(huán)中KLF5、Runx2 mRNA和蛋白均隨鈣化程度增加表達上升，SMα-actin和SM22α隨鈣化程度增加表達下降。
　　小結:在高磷誘導下，VSMC向成骨樣細胞轉化，在VSMC向成骨

8、樣細胞轉化和鈣化過程中伴隨著KLF5和Runx2表達上調，二者表達活性與VSMC鈣化程度呈正相關。
　　第二部分 KLF5在血管平滑肌細胞成骨樣分化中的作用及機制
　　目的:探尋KLF5在高磷誘導VSMC向成骨樣細胞分化過程中的具體機制。
　　方法:分別應用腺病毒過表達KLF5及靶向KLF5的特異性siRNA敲低KLF5，用茜素紅染色和鈣離子含量測定檢測VSMC中鈣鹽沉積程度，real-time PCR和Western

9、 blotting檢測KLF5、Runx2、SMα-actin和SM22α表達。構建Runx2啟動子指導的熒光素酶報告基因質粒，與KLF5表達質粒共轉染血管平滑肌細胞，以熒光素酶報告基因檢查KLF5對Runx2的調控作用。染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析和oligo pulldown方法分析KLF5在Runx2啟動子上的結合位點。
　　結果:鈣離子濃度測定和茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，

10、單純過表達KLF5并不會使VSMC發(fā)生鈣化。然而當給予VSMC高磷刺激時，與轉染空病毒組相比，過表達KLF5組鈣沉積是轉染空病毒組的1.56倍，同時礦化結節(jié)的形成顯著增加。高磷刺激后，Runx2表達量在轉染空病毒組和過表達KLF5組分別增加1.2和2.3倍。給于高磷刺激后，SMα-actin和SM22α的表達活性在過表達KLF5組較轉染空病毒的對照組分別下降40％和30％。離體動脈環(huán)實驗得到相似的結果。
　　與轉染對照siRNA組

11、相比，KLF5敲低之后，給予高磷刺激，VSMC中的鈣沉積下降30％，礦化結節(jié)顯著減少。Runx2表達活性下降了70％，SMα-actin和SM22α的表達水平較對照組明顯增加。
　　報告基因分析顯示，不給于高磷刺激時，KLF5對Runx2基因啟動子的活性無明顯影響，高磷促進KLF5結合到Runx2啟動子區(qū)并誘導其轉錄。ChIP分析結果顯示，在高磷處理的VSMC中，KLF5可結合到Runx2啟動子區(qū)的-185 bp—-27 bp，這

12、個區(qū)段包含4個KLF5結合位點;oligopulldown分析結果顯示，高磷促進KLF5與Runx2啟動子區(qū)近端兩個KLF5結合位點結合的作用大于遠端的兩個位點。
　　小結:KLF5通過直接與Runx2啟動子結合激活其轉錄，高磷通過促進KLF5與Runx2啟動子的結合，進而發(fā)揮其促進VSMC向成骨細胞轉化。
　　第三部分 KLF5在慢性腎衰竭血管鈣化中的作用
　　目的:進一步探討KLF5在整體動物中調控慢性腎衰竭血管鈣

13、化中的作用及機制。
　　方法:用含大鼠0.75％腺嘌呤的飼料飼喂大鼠，生化分析儀測定腎衰竭相關參數(shù)，超聲心動圖評估心臟功能;高分辨率超聲、Von kossa染色和鈣離子測定檢測慢性腎衰竭大鼠主動脈的鈣化情況;免疫組化方法檢測KLF5、Runx2和SMα-actin在鈣化動脈中的表達;Real-time PCR和Westernblotting檢測KLF5和Runx2在主動脈中的表達
　　結果:腺嘌呤成功誘導大鼠出現(xiàn)腎衰竭，肌酐

14、、尿素氮、血磷和鈣磷乘積增加;同時合并有心功能衰竭。超聲顯像和Von kossa染色顯示主動脈出現(xiàn)明顯的鈣化，鈣化區(qū)域鈣離子含量增加，并且血磷水平與血管鈣化呈正相關;鈣化區(qū)域KLF5和Runx2表達量增加，SMα-actin表達量降低，與細胞水平的結果相一致。
　　小結:腺嘌呤飲食誘導的腎衰模型接近尿毒癥血管鈣化的發(fā)病機理，可作為研究慢性腎衰竭血管鈣化的模型，在主動脈鈣化區(qū)域的血管組織中，KLF5和Runx2同時高表達，提示在整體

15、動物中KLF5表達上調與血管鈣化相關。
　　結論:
　　1.高磷誘導VSMC鈣化和KLF5表達。
　　2.KLF5通過直接與Runx2啟動子結合激活其轉錄，高磷通過促進KLF5與Runx2啟動子的結合,進而發(fā)揮其促進VSMC向成骨樣細胞轉化的作用。
　　3.慢性腎衰竭大鼠鈣化血管中KLF5表達增加，VSMC向成骨樣細胞轉化。
　　4.血管鈣化伴隨著VSMC表型轉化，其表型轉化與鈣化的耦聯(lián)是通過KLF5對Ru