microRNA和apelin調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化和凋亡.pdf

1、第一部分 microRNA-204調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化
　　 目的:動脈中膜鈣化是一種常見的大血管病變，它起始于血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨樣細(xì)胞分化的主動調(diào)節(jié)過程。目前調(diào)控這一過程的具體機制還不清楚。特定的microRNA可能通過表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞(osteoblast-like cells)分化。在本實驗中，我們主要探討m

2、iR-204是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。
　　 方法:以β-甘油磷酸鈉干預(yù)小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞，以實時定量PCR檢測miR-204表達水平的改變，以蛋白免疫印跡雜交檢測Runx2表達水平的改變。以miR-204 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞，以蛋白免疫印跡雜交檢測Runx2表達水平的改變，并檢測以β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)后成骨性標(biāo)志物ALP和OC及Runx2蛋白表達水平的改變。將野生型／突變

3、型Runx23’-UTR與miR-204 mimics共轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞，以熒光素酶報告基因策略驗證Runx2是否為miR-204的直接作用靶點。
　　 結(jié)果:β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下小鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生成骨樣細(xì)胞分化，其miR-204表達水平受抑制而Runx2表達水平上調(diào)。以miR-204 mimics轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞能降低Runx2蛋白水平并抑制β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞分化，而以miR-204抑制劑轉(zhuǎn)染的小鼠

4、血管平滑肌細(xì)胞能上調(diào)Runx2蛋白水平并增強β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞分化，提示在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中miR-204為Runx2的內(nèi)源性抑制劑。通過熒光素酶報告基因策略驗證Runx2為miR-204的直接作用靶基因。
　　 結(jié)論: miR-204表達水平的下調(diào)，從而上調(diào)Runx2蛋白表達水平為β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)下血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化發(fā)生的始動因素。miR-204為血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中

5、關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。
　　 第二部分調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的新microRNA克隆及其功能研究
　　 目的:血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨樣細(xì)胞分化在許多血管鈣化疾病的病理過程中起關(guān)鍵作用。近期研究表明，microRNA(miRNA)參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞鈣化過程。本研究的目的在于探尋在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用的新的miRNA。

6、
　　 方法:從小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞抽提小RNA。經(jīng)過Poly(A)加尾并連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行PCR擴增、回收，連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建小分子RNA的cDNA文庫，最后進行菌落PCR，得到陽性克隆送測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析確定新的miRNA(miR-X)，并以Northern印記雜交驗證。以生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-X的作用靶基因。通過轉(zhuǎn)染miR-X前體（功能獲得研究）和miR-X抑制劑（功

7、能缺失研究）調(diào)節(jié)miR-X的表達水平。測定轉(zhuǎn)染前后血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化程度和靶基因表達水平的改變。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)了主要表達于血管平滑肌細(xì)胞的新miRNA——miR-X，并發(fā)現(xiàn)它的表達水平在血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中表達減少。轉(zhuǎn)染pre-miR-X能減少β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞ALP活性、骨鈣素分泌、Runx2蛋白表達和礦化水平，而轉(zhuǎn)染miR-X抑制劑能增加血管平滑肌細(xì)胞ALP活性、骨鈣素分泌和

8、Runx2蛋白表達水平。通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測FosB為miR-X的直接作用靶基因。miR-X過表達能下調(diào)FosB蛋白表達水平，對FosBmRNA表達水平卻無影響。
　　 結(jié)論:miR-X表達水平的下調(diào)通過作用于靶基因FosB參與調(diào)節(jié)β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程。
　　 第三部分Apelin通過APJ/PI3-K/Akt信號通路抑制人血管平滑肌細(xì)胞凋亡
　　 目的:血管平滑肌細(xì)胞(vas

9、cular smooth muscle cells，VSMCs)的凋亡在心血管疾病中的血管重塑方面起重要的調(diào)控作用。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。但是apelin是否參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞凋亡過程仍未可知。本實驗將以人原代血管平滑肌細(xì)胞為模型，探討apelin對人血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用及參與調(diào)節(jié)的信號通路。
　　 方法:以Western免疫印跡檢測APJ在血管平滑肌細(xì)胞中的表達水平

10、。以血清饑餓法誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，以apelin重組蛋白干預(yù)細(xì)胞，以細(xì)胞凋亡ELISA檢測法及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡水平。以siRNA沉默血管平滑肌細(xì)胞APJ的表達后，再檢測apelin對細(xì)胞凋亡的影響。以Western免疫印跡檢測apelin對Bcl-2、Bax蛋白及MAPK、Akt磷酸化水平的影響，再檢測使用相應(yīng)的信號通路阻斷劑及APJ的siRNA后信號通路的激活及細(xì)胞凋亡水平的變化。
　　 結(jié)果:Western免疫印

11、跡檢測出APJ在人原代血管平滑肌細(xì)胞中表達。Apelin能抑制血清饑餓誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞凋亡。通過siRNA沉默APJ的表達能阻斷apelin的抗凋亡作用。apelin上調(diào)Bcl-2的表達，下調(diào)Bax的表達。apelin還能激活ERK(extra-cellularsignal-regulated protein kinase，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)和Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶下游效應(yīng)物）信號通路。APJ的siRNA能阻斷apel