鎂離子對高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化作用的研究.pdf

1、目的:
　　高磷是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者血管中膜鈣化的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可引起心血管事件等嚴(yán)重并發(fā)癥，其誘導(dǎo)鈣化的機(jī)制可能是通過血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)膜上的Ⅲ型鈉磷轉(zhuǎn)運(yùn)體(Pit-1)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起VSMCs表型轉(zhuǎn)化而發(fā)生鈣化。進(jìn)一步研究顯示鎂離子既可以抑制Pit-1通道活性而減少磷向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，又可以競爭性地拮抗細(xì)胞內(nèi)的磷，對細(xì)胞內(nèi)的磷水平的調(diào)節(jié)起一定的作用，但鎂離子與血管平

2、滑肌細(xì)胞鈣化的關(guān)系目前尚不清楚。本研究旨在通過高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化模型來探討鎂離子和VSMCs鈣化兩者之間的關(guān)系，以明確鎂離子在VSMCs鈣化中的作用。
　　方法:
　　1 VSMCs原代培養(yǎng)
　　運(yùn)用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)獲取VSMCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞鑒定，并繪制正常平滑肌細(xì)胞生長曲線。
　　2實(shí)驗(yàn)分組及處理
　　VSMCs隨機(jī)分為陰性對照組、高磷組及鎂干預(yù)組，陰性對照組采用低糖DMEM含10％胎

3、牛血清的正常培養(yǎng)基，高磷組在正常培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸制成高磷培養(yǎng)基，鎂干預(yù)組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入氯化鎂，使鎂離子的終濃度分別為1 mmol/L(鎂干預(yù)組1)、2 mmol/L（鎂干預(yù)組2）和3mmol/L（鎂干預(yù)組3），共刺激7d。
　　3不同濃度鎂離子對VSMCs鈣化的影響
　　VSMCs鈣化檢測分別用茜素紅(Alizarin red stain)鈣化染色和比色法測定細(xì)胞內(nèi)鈣含量的方法。

4、
　　4不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響取3～5代細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度約為2×105/孔，干預(yù)時間為7d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2～3次，每孔加入500μL0.1％TritonX-100置4℃環(huán)境中約12～24 h，然后反復(fù)吹打裂解細(xì)胞后置于離心管中離心，按化學(xué)發(fā)光法檢測ALP活性。
　　5不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs Cbfα1 mRNA表達(dá)的影響
　　運(yùn)用RT-PCR方法

5、研究不同濃度鎂離子對VSMCs中Cbfα1 mRNA水平表達(dá)的影響。
　　6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間均數(shù)兩兩比較用SNK檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 VSMCs原代培養(yǎng)
　　采用組

6、織塊貼壁法獲取原代大鼠VSMCs，通常情況下貼壁的動脈組織塊約3～4 d后可爬出少許細(xì)胞，以長梭形為主，排列較分散，隨著時間延長細(xì)胞數(shù)目顯著增多，約6～7 d細(xì)胞可鋪滿大部分瓶底。當(dāng)細(xì)胞數(shù)目占瓶底面積的80～90％時可傳代，傳代后細(xì)胞起初為圓形或橢圓形，貼壁后可逐漸伸展為梭形，胞漿豐富，核呈圓形或卵圓形，多個細(xì)胞交錯重疊生長，呈典型的“峰-谷”樣。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測平滑肌細(xì)胞特異性的抗體—α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA actin

7、)，其陽性結(jié)果為細(xì)胞胞漿強(qiáng)表達(dá)，呈棕黃色的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。
　　2不同濃度鎂離子對VSMCs鈣化的影響
　　運(yùn)用茜素紅鈣化染色對VSMCs染色結(jié)果示:各實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組相比，VSMCs鈣化染色均不同程度地加重，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大鈣化結(jié)節(jié)染色程度逐漸降低，當(dāng)鎂離子濃度為2mmol/L開始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)縮小，呈濃度依賴性，3 mmol/L時鈣化結(jié)節(jié)顯著降低，達(dá)最小狀態(tài)。
　　運(yùn)用比色法測定VSMCs

8、內(nèi)鈣含量結(jié)果示:與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加，鎂干預(yù)組與高磷組相比，鈣含量隨著鎂離子的變化而變化，其結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，即鎂離子濃度越大，鈣含量越低，并當(dāng)鎂離子濃度為2 mmol/L開始鈣含量明顯降低，當(dāng)鎂離子濃度達(dá)3 mmol/L時，鈣含量檢測結(jié)果也相應(yīng)達(dá)最小值，且各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs ALP活性的影響
　　鎂離子刺激VSM

9、Cs后不同組間ALP結(jié)果示:與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組VSMCs ALP水平均不同程度地增加。鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，ALP活性的變化趨勢與鈣含量結(jié)果相似，亦呈濃度依賴性，3 mmol/L時ALP活性達(dá)最小值。
　　4不同濃度鎂離子對鈣化的VSMCs Cbfα1 mRNA表達(dá)的影響
　　不同濃度鎂離子刺激VSMCs后不同組間Cbfα1 mRNA的表達(dá)結(jié)果示:與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預(yù)組的VS

10、MCs Cbfα1 mRNA水平均不同程度地增加，而鎂干預(yù)組與高磷組比較，隨著鎂離子濃度的增大，Cbfα1 mRNA水平也相應(yīng)發(fā)生變化，變化趨勢與鎂離子濃度相關(guān)，呈濃度依賴性，當(dāng)鎂離子濃度為3 mmol/L時mRNA水平降至最低，不同組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1鎂離子可抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，且呈濃度依賴性。
　　2鎂離子抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化的機(jī)制可能是通過抑制VSMCs轉(zhuǎn)分化作用來實(shí)現(xiàn)