晚期糖基化終產(chǎn)物受體通過AKT通路作用于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白對(duì)前列腺癌增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在癌癥的分類上，前列腺癌是全球第六大癌癥，又是全球男性第二大癌癥。同時(shí)其發(fā)病率增長速度也明顯增快，由2001年的第8位上升到了2010年的第6位。歐美國家發(fā)病率在100/10萬以上，美國年發(fā)病13萬例。雖然歐美國家發(fā)病率顯著高于我國，但一些大城市的流行病學(xué)調(diào)查表明，目前前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)直追歐美國家。前列腺癌發(fā)病率在我國顯著增長可能跟人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變、生活環(huán)境的污染以及檢

2、測技術(shù)的發(fā)展息息相關(guān)。隨著前列腺癌發(fā)病率的顯著增長，對(duì)前列腺癌的研究也越來越多。目前對(duì)前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究的主要方面在細(xì)胞調(diào)節(jié)信號(hào)通路和雄激素受體的突變、基因擴(kuò)增上。其中研究的熱點(diǎn)主要集中在對(duì)前列腺癌的發(fā)病機(jī)制中信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究，因?yàn)樗菑姆肿铀綄用嫔系玫礁嗉膊〉陌l(fā)生與發(fā)展的信息，為徹底治療疾病提供良好的依據(jù)。某些研究表明，原癌基因ras、Fos、c-myc、c-met、Bcl-2等的激活和表達(dá)上調(diào)，抑癌基因Rb、p53、p16、

3、PTEN、CDKN2等的失活、蛋白AR（androgen receptor，雄激素受體）、前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cellantigen，PSCA)等的異常表達(dá)以及啟動(dòng)子甲基化及DNA損傷應(yīng)答通路異常可能參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中。而最近研究發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)與前列腺癌也密切相關(guān)。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(r

4、eceptor for advanced glycation end products，RAGE)是晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced end products，AGE）的受體，其編碼基因位于Ⅲ類主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHCⅢ)區(qū)域。RAGE最早在1992年報(bào)導(dǎo)，且在過去的20年里，它被認(rèn)為在糖尿病、敗血癥、炎癥和腫瘤發(fā)展中有重要作用?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，RAGE作為信號(hào)通

5、路的一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體和其配體在單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合，從而激活內(nèi)部各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，發(fā)生病理效應(yīng)。RAGE在腫瘤的作用是近十多年才發(fā)現(xiàn)的，目前的研究表明，RAGE在除肺癌之外的許多腫瘤表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后密切關(guān)聯(lián)。我們前期的研究表明，RAGE可能與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RetinoblastomaProtein，Rb)蛋白相互作用促進(jìn)前列腺癌的增殖。Rb基因是人類最早發(fā)現(xiàn)的

6、一種抑癌基因，基因產(chǎn)物是110 kd的具有DNA結(jié)合能力的核磷蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞生長起負(fù)調(diào)控作用。未磷酸化的Rb蛋白起抗癌作用，而磷酸化的Rb蛋白則沒有這個(gè)作用。Rb蛋白和轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合并抑制其活性，使細(xì)胞停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Rb蛋白被磷酸化時(shí)，就會(huì)從轉(zhuǎn)錄因子E2F解離下來，導(dǎo)致促使DNA合成相關(guān)的酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，引起細(xì)胞增殖。前列腺癌中大多數(shù)Rb等位基因丟失而導(dǎo)致Rb

7、蛋白作用喪失。同時(shí)在60％前列腺癌臨床病例可觀察到Rb雜合子的丟失。Maddison的研究表明，Rb的失活引起E2F表達(dá)增多，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Taneja SS等研究表明在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解Rb蛋白的過程中，可能有雄激素的參與，且其降解過程可為cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1誘導(dǎo)的Rb磷酸化所加速，從而促進(jìn)了LNCaP細(xì)胞的生長。也有研究表明Rb蛋白能夠與雄激素受體蛋白特異性結(jié)合增強(qiáng)雄激素受體的轉(zhuǎn)

8、錄活性，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。在我們前期的工作中，我們證實(shí)AGE與RAGE間相互作用能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，且這種作用可能跟RB蛋白的表達(dá)有關(guān)，但是具體的作用方式尚未清楚。Ning等人的研究證明，跟細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的某些蛋白如RB可能受AKT信號(hào)通路調(diào)控，我們推測RB蛋白的變化可能是通過AKT通路引起的。Akt是存在于人類染色體中的病毒原癌基因v-Akt的同源物，本質(zhì)也是一種原癌基因;其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物PKB是分子量約為57 k

9、d的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的核心蛋白。Akt家族的成員有Aktl/PKBa，Akt2/PKBp，Akt3/PKB7三種亞型，分別定位于14q32.32，19q13.1-q13.2，lq44。Akt三個(gè)亞型均能活化下游底物，其中又以Akt2的作用最明顯。Sale[47]利用亞型特異的反義寡核苷酸探針策略對(duì)Akt及其三個(gè)亞型的功能進(jìn)行研究，Akt的三個(gè)亞型不但有80％以上的同源性的氨基酸序列，而且均有共同結(jié)

10、構(gòu)特征。其共同結(jié)構(gòu)特征包括三個(gè)不同的功能區(qū)域，分別為氨基末端的PH區(qū)域、中央?yún)^(qū)的重要激酶區(qū)以及羧基末端的調(diào)節(jié)區(qū)。這三個(gè)功能區(qū)在PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分別擔(dān)當(dāng)著重要的作用。PH區(qū)域由約100個(gè)氨基酸序列和3-磷酸肌醇結(jié)合區(qū)域組成，主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-脂質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用;中央?yún)^(qū)的重要激酶區(qū)與PKA、PKC有高度的相似性，Akt部分活化所必需的Thr-308位于該區(qū)域;羧基末端的調(diào)節(jié)區(qū)由40個(gè)氨基酸系列組成，其中包含有蛋白激酶

11、的一個(gè)特征性疏水基序F-X-X-F/Y-S/T-Y/F(X是任意氨基酸)，Akt完全活化所必需的絲/蘇氨酸殘基的磷酸化也位于這個(gè)區(qū)域。研究表明，Akt的活化參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展?？赡艿闹饕獧C(jī)制是由于基因PIK3CA編碼的PI3K蛋白的擴(kuò)增和其他各種因素導(dǎo)致的Akt的過度活化，或者是缺失了某些調(diào)控成分的功能，如PTEN。在前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、濾泡狀甲狀腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、惡性黑色素瘤中都存在Akt的過度表達(dá)，

12、而約50％～80％進(jìn)展期前列腺癌患者中存在PTEN功能的缺失，從而導(dǎo)致了第二信使(PIP3)的過量表達(dá)，引起Akt蛋白的過度激活，增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的存活。Gao等證實(shí)了在前列腺癌患者中Aktl通過干擾APC/Cdhl與Skp2結(jié)合從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，Akt除了促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖外，還抑制細(xì)胞凋亡。Akt通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)AKT跟凋亡有關(guān)的多個(gè)家族和蛋白之間存在相互作用，如Bcl-2家族、Foxo家族、

13、IAPs(inhibitor of apop-tosis proteins)和caspase-9?？傊?xì)胞存活通路PI3K/Akt中的重要分子-AKT，在促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖、侵襲和浸潤，以及抑制細(xì)胞凋亡中起著核心的作用。我們已經(jīng)初步證明了RAGE與Rb蛋白在前列腺癌中存在某種關(guān)系，但兩者之間的這種相互作用是直接的還是間接的，它們發(fā)生聯(lián)系是依靠何種方式，有什么信號(hào)通路參與其中，且這種相互作用對(duì)前列腺的發(fā)生發(fā)展有何意義？當(dāng)弄清楚這些問題的

14、答案時(shí)，我們不但能夠更清楚理解RAGE及Rb蛋白的功能，而且將對(duì)前列腺癌乃至其它相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)防診治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 方法：基于以上認(rèn)識(shí)，本研究首先進(jìn)行用Western Blotting檢測前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞中的胞質(zhì)和胞核中RAGE的表達(dá)，以明確RAGE的定位，同時(shí)推測RAGE與RB蛋白的作用方式;接著我們用AGEs對(duì)前列腺癌進(jìn)行不同時(shí)間段和不同濃度刺激，以觀察前列腺癌細(xì)胞中Rb蛋白及RB蛋白磷酸化

15、Ser-807/811位點(diǎn)的表達(dá)情況。然后我們檢測同一條件下，AKT蛋白及AKT蛋白磷酸化Ser473、Thr308位點(diǎn)的表達(dá)情況。我們?cè)赑C-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了干擾RB蛋白的RNA小片段，以尋求一種阻斷RB蛋白表達(dá)的方法。最后我們構(gòu)建缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表達(dá)載體，以確定RAGE與Rb蛋白兩者間相互作用的條件。
　　 結(jié)果：⑴證實(shí)RAGE主要在前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞漿中分布;⑵初步證實(shí)AGEs刺激PC-3細(xì)胞能導(dǎo)

16、致RB蛋白的表達(dá)下調(diào)及磷酸化增強(qiáng)，Rb蛋白的表達(dá)下調(diào)及磷酸化增強(qiáng)可能通過是RAGE與AGEs作用所激活的AKT信號(hào)通路所介導(dǎo)的;⑶初步證實(shí)AGEs刺激PC-3細(xì)胞能導(dǎo)致AKT蛋白的磷酸化增強(qiáng)，AKT蛋白磷酸化增強(qiáng)是可能通過RAGE與AGEs作用所激活的;⑷成功干擾了前列腺癌中RB蛋白的表達(dá);⑸成功地構(gòu)建了缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表達(dá)載體，其能夠在PC-3細(xì)胞中表達(dá)。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)RAGE與Rb蛋白的相