抗性基因KR3在大豆中的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、大豆在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到病毒的影響，病毒病不僅影響產(chǎn)量，而且能使籽粒發(fā)病形成褐斑，品質(zhì)下降，影響出口外銷。植物中存在一類抗病基因——R基因(Resistance gene)，國(guó)內(nèi)外研究表明R基因能與病毒產(chǎn)物直接或間接互作，識(shí)別病原體從而產(chǎn)生反應(yīng)信號(hào)，啟動(dòng)植物體內(nèi)的防衛(wèi)機(jī)制。利用基因工程技術(shù)將抗病基因轉(zhuǎn)入大豆，是培育廣譜、持久抗病大豆品種的育種新策略。
　　KR3基因是大豆6號(hào)染色體上的一段NBS-LRR-TIR類抗病基因，具有

2、p-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDD)、Kinase-3a（GS/TR）、疏水結(jié)構(gòu)域(HD，GLPLAL)等抗病基因保守結(jié)構(gòu)的氨基酸編碼序列。進(jìn)一步的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，KR3蛋白卷曲結(jié)構(gòu)為37.9％，螺旋結(jié)構(gòu)為49.3％，折疊結(jié)構(gòu)為12.7％，其中卷曲結(jié)構(gòu)可能與抗病基因NBS結(jié)構(gòu)域的抗病識(shí)別有關(guān)，而螺旋結(jié)構(gòu)則可能與LRR結(jié)構(gòu)域的存在有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，KR3基因與煙草N基因親緣關(guān)系較近，同源性對(duì)比為37

3、％，因而可能是大豆中具有功能類似N基因的一類抗病基因。RT-PCR結(jié)果表明KR3基因本身表達(dá)量較低，但在外源水楊酸處理60h后達(dá)到最大值，隨后又逐漸下降。
　　本研究從基因芯片中克隆到KR3基因片段，并將該片段以Gateway克隆的方式構(gòu)建成植物表達(dá)載體，采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系將抗性基因KR3導(dǎo)入受體天隆一號(hào)中，共轉(zhuǎn)化386個(gè)外植體，獲得轉(zhuǎn)基因生根苗15株，經(jīng)草丁膦涂抹、Bar試紙條和PCR鑒定，最終獲得1