大豆再生系統(tǒng)的建立及CPTI基因轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文大豆再生系統(tǒng)的建立及CPTI基因轉(zhuǎn)化研究姓名：紀(jì)曉東申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：王關(guān)林19990420天且再生系統(tǒng)的建立廈CPTI基因轉(zhuǎn)化研究法必須具備受體系統(tǒng)。目前，已經(jīng)建立和完善了組織，細(xì)胞和原生質(zhì)體水平的植株再生系統(tǒng)。121農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆基因轉(zhuǎn)化所謂農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆基因轉(zhuǎn)化，是通過(guò)農(nóng)桿菌侵染而將所帶有的TDNA導(dǎo)入植物細(xì)胞引起相應(yīng)的植物細(xì)胞發(fā)生可遺傳的變異。1211大豆易感性的研究根據(jù)資料記載

2、農(nóng)豐T菌侵染轉(zhuǎn)化與大豆的基因型有關(guān)，不同的基因型對(duì)不同的質(zhì)粒有重疊也有差異。此外，大豆的易感性還與不同生長(zhǎng)剛期，外界環(huán)境，接種時(shí)間以及其培養(yǎng)溫度(3234“(2將阻斷穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)等因素有關(guān)。1，2，l，2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的研究土壤中的農(nóng)桿菌主要分為章魚(yú)堿型(Octopine)，胭脂堿型(Nopaline)，農(nóng)桿堿型(Agropine)和琥珀堿型(Suceinamopine)等菌系。Byme以peking為材料對(duì)章魚(yú)堿型和胭脂堿型農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能

3、力進(jìn)行了研究，以致瘤頻率和瘤的大小為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化能力的差異主要是質(zhì)粒的差異所致，胭脂堿型的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)于章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒。Savaka镩以lO個(gè)栽培大豆品種為材料測(cè)試了4株發(fā)根農(nóng)柯菌的轉(zhuǎn)化能力，發(fā)現(xiàn)它們感染轉(zhuǎn)化能力大小也有差異。不同農(nóng)桿菌質(zhì)粒之間的差異同時(shí)表現(xiàn)在T區(qū)和Vir區(qū)，但到底哪一區(qū)的差異導(dǎo)致了它們轉(zhuǎn)化能力豹差異還未見(jiàn)報(bào)道。1213農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化Foceiotti首先進(jìn)行了融合基因轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，測(cè)試的轉(zhuǎn)化

4、愈傷組織Km’性狀，PolyA‘RNA增加情部及NPTll酶活性，都表現(xiàn)出了光誘導(dǎo)表達(dá)。Hinehee等，首次通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株同時(shí)發(fā)現(xiàn)再生植株后代以3：1分離。應(yīng)用改良的Hinehee方法，James和Atherly獲得了玉米Ac因子的大豆轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)組織化學(xué)染色法和Sout[1emhlot法都檢測(cè)到了AC因子的表達(dá)。Parrot等以未成熟子葉為材料對(duì)14個(gè)大豆品種的9800個(gè)子葉進(jìn)行感染轉(zhuǎn)化研究，得到t3云扁豆蛋白

5、啟動(dòng)子15KD玉米醇溶蛋白基因和NPTII基因的轉(zhuǎn)化植株。但是由于組織水平的嵌合性，所得到的3株轉(zhuǎn)化植株的后代部不是轉(zhuǎn)化的。Chee等為了避免再生植株的困難，直接在萌發(fā)種子的胚芽子葉節(jié)和子葉附近接種農(nóng)桿菌，結(jié)果4000粒發(fā)芽種子中，只有16株有NPTII雜交帶，其中有l(wèi)o株的雜交帶特別強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)，被認(rèn)為已經(jīng)轉(zhuǎn)化的IO株Fn中只有一株能產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的后代，但這株F。所產(chǎn)生的36株后代中只有3株含有NPTII基因?？傊?，影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺

6、傳轉(zhuǎn)化頻率的因素有：(1)大豆基因型，(2)農(nóng)稈菌基因型；(3)外植體，(4)酚類化合物，(5)農(nóng)桿菌的接種時(shí)間，方式；(6)共培養(yǎng)條件；(7)選擇的時(shí)間，方式等。122大豆電擊法基因轉(zhuǎn)化電擊遺傳轉(zhuǎn)化的基本原理是電擊或PEG／電擊處理下，細(xì)胞膜透性的可逆變化使得溶液中的大分子(DNA)進(jìn)入細(xì)胞，并改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)構(gòu)成。影響電擊轉(zhuǎn)化法的因素很多。如PEG最經(jīng)濃度，DNA和PEG加入的次序，二價(jià)陽(yáng)離子(c礦，M礦可促進(jìn)原生質(zhì)體對(duì)DNA的吸