自體肝移植的臨床和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1）探討離體全肝切除自體肝移植術(shù)(ELRA)治療晚期肝臟泡球蚴病(AE)的適應(yīng)癥，可行性，安全性和有效性；評(píng)價(jià)三維重建影像評(píng)估系統(tǒng)與個(gè)體化虛擬手術(shù)的臨床意義；初步探討ELRA術(shù)后移植物增生的規(guī)律；評(píng)價(jià)ELRA術(shù)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益；
　　2）建立Wistar大鼠極限肝切除模型，評(píng)價(jià)極限肝切除術(shù)后的肝再生和存活率；
　　3）建立Wistar大鼠慢性肝損傷模型，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和慢性肝纖維化肝再生修

2、復(fù)的關(guān)系及可能機(jī)制；
　　4）探討TLR3通路與BMSCs在慢性肝纖維化中的相互作用和與肝纖維化肝再生修復(fù)的可能機(jī)制。
　　方法：
　　課題第一部分：
　　1）總結(jié)2010年8月至2013年08月按納入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施的10例ELRA術(shù)治療晚期肝AE患者的臨床資料，分析臨床資料，探討臨床適應(yīng)癥；
　　2）通過(guò)術(shù)前CT與三維肝臟重建軟件測(cè)量數(shù)據(jù)和手術(shù)探查所見(jiàn)與移植物實(shí)際質(zhì)量結(jié)果分析，分析個(gè)體化虛擬手術(shù)設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性和可

3、行性。
　　3）通過(guò)患者術(shù)中情況、并發(fā)癥和住院總費(fèi)用等臨床資料，分析手術(shù)可行性和安全性。
　　4）術(shù)后CT隨訪(fǎng)1,3和6月移植肝體積(GV)和受體標(biāo)準(zhǔn)肝體積(SLV)比，結(jié)合術(shù)后PET/CT檢查結(jié)果，分析半年內(nèi)肝臟增生變化。
　　課題第二部分：對(duì)Wistar大鼠分別行70％、80%、90%肝體積極限切除，統(tǒng)計(jì)術(shù)后各組大鼠的存活率，并檢測(cè)外周血清中ALT及AST濃度，對(duì)比術(shù)后14天存活大鼠肝臟質(zhì)量。HE染色觀(guān)察三組肝臟組

4、織形態(tài)學(xué)變化。
　　課題第三部分：取雄性大鼠股骨和脛骨骨髓，提取、分離培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增 BMSCs，使用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察 BMSCs的形態(tài)，用免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè) BMSCs表面 CD31、CD45、CD44、CD105、CD11b、CD29的表達(dá)陽(yáng)性率。用二乙基亞硝胺（DEN）配成0.01%濃度飲用水供雌性大鼠飲用16周換正常水，建立慢性肝損傷模型,第4、8、12、16周經(jīng)尾靜脈輸注1×106個(gè)BMSCs,并設(shè)置單純?cè)炷＝M及

5、空白對(duì)照組；20周核磁共振（MRI)檢查大鼠肝臟；21周處死大鼠，HE染色觀(guān)察肝臟組織形態(tài)變化；原位雜交技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟SrY表達(dá)；VG染色觀(guān)察肝臟中膠原纖維量；IHC檢測(cè)α-SMA、TLR3；Western-blotting檢測(cè)肝臟α-SMA、TLR3、TRIF、NF-kBp65、IRF3表達(dá)，F(xiàn)Q-RT-PCR檢測(cè)TLR3、IRF3 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　課題第一部分：
　　1）10例移植物均存活，符合納

6、入標(biāo)準(zhǔn)時(shí)手術(shù)安全性較高。
　　2）術(shù)中探查與移植物體積和術(shù)前CT與肝臟三維重建結(jié)果一致，10例患者GV/SLV在41%-78%之間，平均60.6%，其中9例患者虛擬切除移植物體積695.11±142.14cm3，實(shí)際余肝臟體積687.78±130.81cm3（P＞0.05）；
　　3）術(shù)中1例經(jīng)臍靜脈低溫灌注外，余9例經(jīng)門(mén)靜脈灌注；2例無(wú)肝期未搭橋，3例下腔靜脈搭橋，5例人造血管腔靜脈搭橋臨時(shí)性門(mén)體分流；手術(shù)11.5～20.

7、5h，平均15.2h，無(wú)肝期200-435min，中位時(shí)間285.5min，術(shù)中輸注紅細(xì)胞懸液0～15u，術(shù)后住院時(shí)間21～58d，總并發(fā)癥發(fā)生率6例（60%）；住院總費(fèi)用10.16～43.48萬(wàn)元，中位費(fèi)用17.44萬(wàn)元；
　　4)CT測(cè)術(shù)后第1月移植物體積平均增加14.75%；術(shù)后2～3月平均每月增加3.75%；術(shù)后4～6月平均每月增加3.08%；術(shù)后半年移植物/標(biāo)準(zhǔn)肝體積比平均87.5%；PET/CT測(cè)18氟-脫氧葡萄糖（1

8、8F-FDG）的平均標(biāo)準(zhǔn)攝取率（SUVave）0.9～1.9；隨訪(fǎng)時(shí)間2～37個(gè)月，1例術(shù)后6個(gè)月死亡，最長(zhǎng)存活時(shí)間27個(gè)月。
　　課題第二部分：
　　1)大鼠肝切術(shù)后6h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，術(shù)后8-12h為死亡高峰，70%、80%、90%肝體積切除組2周存活率分別為86.7%、80%、7%。
　　2）80%及90%肝體積切除組術(shù)后8h、12h時(shí)血清ALT、AST濃度比70%組顯著增高（P﹤0.05），而80%與90%組之間

9、無(wú)差異（P﹥0.05）；80%組術(shù)后24h、3天時(shí)血清ALT及AST濃度比70%肝體積切除組高（P﹤0.05）；術(shù)后7天左右各組ALT及AST濃度基本恢復(fù)正常。
　　3)術(shù)后14天80%組剩余肝體積明顯大于70%肝體積切除組（P﹤0.05）。
　　4）三組肝臟組織形態(tài)無(wú)明顯異常。
　　課題第三部分：
　　1）P3代BMSCs細(xì)胞表面的CD31、CD45、CD44、CD105、CD11b、CD29的陽(yáng)性率分別為（1

10、2.0%、8%、1.2%、62.2%、1.5%、16.7%）；
　　2)原位雜交技術(shù)檢測(cè)示僅有BMSCs移植組表達(dá)SrY。
　　3）核磁共振結(jié)果示BMSCs移植組肝臟上結(jié)節(jié)數(shù)量比單純?cè)炷＝M多（P<0.05）；
　　4）HE染色顯示單純?cè)炷＝M8只輕度肝纖維化形成；BMSC移植組中9只形成明顯的肝纖維化，1只形成肝癌；空白對(duì)照組無(wú)肝纖維化形成。
　　5)IHC顯示BMSCs移植組比單純?cè)炷＝Mα-SMA陽(yáng)性表達(dá)率高(P

11、<0.05)；空白對(duì)照組無(wú)表達(dá)。TLR3主要表達(dá)于肝細(xì)胞包漿中；
　　6）VG染色BMSCs移植組膠原區(qū)的百分比數(shù)比單純?cè)炷＝M高(P<0.05）。
　　7）western blotting結(jié)果顯示BMSCs移植組比單純?cè)炷＝Mα-SMA蛋白水平高(P<0.05)，BMSCs移植組肝臟中TLR3、NF-kBp65、IRF3蛋白水平及 TLR3、IRF3mRNA表達(dá)比空白對(duì)照組和單純?cè)炷＝M都高（P均<0.05），單純?cè)炷＝M稍高于空

12、白對(duì)照組（P<0.05）；而TRIF蛋白表達(dá)水平在三組間無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）對(duì)于外科原位手術(shù)切除極為困難或無(wú)法切除的晚期肝AE可以通過(guò)ELRA術(shù)治療，適應(yīng)癥為本研究納入標(biāo)準(zhǔn)；CT和三維肝臟重建軟件能夠在術(shù)前準(zhǔn)確評(píng)估肝臟病灶與主要管道關(guān)系，評(píng)價(jià)病灶侵犯程度和預(yù)測(cè)移植物體積，提高手術(shù)安全性；在無(wú)肝期個(gè)體化處理進(jìn)行人造血管腔靜脈搭橋，臨時(shí)性門(mén)體分流技術(shù)，下腔靜脈免重建技術(shù)和離體肝切除血管重建技術(shù)等綜合

13、應(yīng)用安全、有效；術(shù)后移植肝再生主要發(fā)生于術(shù)后半年內(nèi)，尤其是術(shù)后第1個(gè)月，術(shù)后2～6月明顯放緩，半年后基本接近患者標(biāo)準(zhǔn)肝體積；ELRA術(shù)治療晚期肝AE有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，有助于在國(guó)內(nèi)外推廣應(yīng)用；
　　2）大鼠肝切除量在80%以下是安全的，提示對(duì)于正常成人極限肝切體積有可能超越70%；且肝臟切除量越大，肝臟增生體積越多；
　　3）BMSCs在DEN所致的慢性肝損傷模型中具有促進(jìn)肝纖維化的作用，并有致肝癌的可能；
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