骨橋蛋白激活NF-κB通路調(diào)控OA軟骨細(xì)胞MMP-13與Ⅱ型膠原表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)在骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)中的調(diào)控作用，探討其可能涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并初步觀察OPN對(duì)OA軟骨細(xì)胞的功能學(xué)效應(yīng)。
　　方法:
　　1、取13名非OA患者（8男5女，年齡53.1±-12.8歲）和13名OA患者（6男7女，年齡68.8±7.9歲）的髖、膝關(guān)節(jié)軟骨組織，Real-timeQ PCR技術(shù)檢測(cè)比較兩組軟骨標(biāo)本中OPN及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（m

2、atrix metalloproteinase-13，MMP-13）基因表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析OPN與MMP-13表達(dá)的相關(guān)性。Ⅱ型膠原酶一步消化法處理OA軟骨組織，分離培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞并傳代，取第一代OA軟骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，予以1ug/ml濃度的OPN干預(yù)，分別采用Real-time Q PCR和WesternBlotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(0h，24h，48h，72h) MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)水平;然后以不同濃度的OPN（0，

3、0.5，1，2，4ug/ml）干預(yù)OA軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)48h后再次觀察MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，確定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中OPN干預(yù)效用最強(qiáng)的最佳濃度及時(shí)間。
　　2、取第一代OA軟骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組和PDTC(Pyrrol idinedithiocarbamic acid，inhibitor of NF-κB)組，每組再分為Con-siRNA亞組、OPN-siRNA亞組、OPN亞組。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組NF-κB

4、(nuclear factor-κappaB) p65核內(nèi)外的表達(dá)情況，WesternBlotting檢測(cè)各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、MMP-13、Ⅱ型膠原的蛋白水平。
　　3、構(gòu)建、包裝、制備OPN-shRNA慢病毒載體備用，取第一代OA軟骨細(xì)胞，分為空白對(duì)照、Con-shRNA、OPN-shRNA、OPN四組，MTT和BrdU兩種不同方法檢測(cè)比較四組OA軟骨細(xì)胞增殖能力的差異。
　　結(jié)果:
　　

5、1、與非OA患者比較，OA患者軟骨組織中OPN及MMP-13基因均高表達(dá)（OPN0.848±0.068 VS1.281±0.085，P=0.0010; MMP-130.971±0.081 VS1.269±0.079，P=0.0091），且軟骨組織中MMP-13的表達(dá)水平與OPN呈正相關(guān)（R2=0.761，P＜0.001）;1ug/ml OPN于預(yù)軟骨細(xì)胞24h后，MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增高(P=0.0039;P=0.00

6、41)，48h時(shí)達(dá)到峰值(P=0.0001;P=0.0004)，72h時(shí)其表達(dá)仍處于高水平(P=0.0001;P=0.0004);不同濃度OPN干預(yù)軟骨細(xì)胞48h后，MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)均增高，且1 ug/ml濃度組增高最顯著(P=0.007; P=0.003)。
　　2、OPN干預(yù)OA軟骨細(xì)胞后，NF-κB p65核內(nèi)移表現(xiàn)增加，OPN-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后核內(nèi)移減少。OPN可顯著上調(diào)NF-κB p65(P=0.0

7、027)、p-NF-κB p65(P=0.0021)、MMP-13(P=0.0079)的蛋白表達(dá)水平，并下調(diào)Ⅱ型膠原表達(dá)水平(P=0.0188);轉(zhuǎn)染OPN-siRNA后，NF-κB p65(P=0.0026)、p-NF-κB p65(P=0.0168)、MMP-13（P=0.0023）蛋白表達(dá)水平明顯下降，Ⅱ型膠原水平則顯著上升(P=0.0226); NF-κB抑制劑(PDTC)可明顯拮抗OPN對(duì)以上四種因子的調(diào)控效應(yīng)（p65 P=0

8、.00320; p-p65 P=0.0346;MMP-13 P=0.0213;Ⅱ型膠原P=0.0422）。
　　3、OPN-shRNA可成功感染OA軟骨細(xì)胞，抑制OPN基因及蛋白的表達(dá)，感染率達(dá)80％以上;MTT試驗(yàn):與對(duì)照組相比，OPN-shRNA組OA軟骨細(xì)胞OD(490nm)值在第2、3、4、5天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯下降(P＜0.05)，OPN干預(yù)組OD(490nm)值顯著增加(P＜0.05);Brdu實(shí)驗(yàn):24h時(shí)，四組細(xì)胞O

9、D(490nm)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);48h后，OPN-shRNA組OA軟骨細(xì)胞OD(490nm)值較對(duì)照組明顯下降(P=0.0162)，OPN干預(yù)組OD(490nm)值顯著增加(P=0.0287)。
　　結(jié)論:
　　1、OPN可上調(diào)OA軟骨組織和細(xì)胞中MMP-13的表達(dá);
　　2、OPN可加速OA軟骨細(xì)胞NF-κB p65核內(nèi)移，上調(diào)NF-κBp65、p-NF-κB p65、MMP-13蛋白表達(dá)的水平，下調(diào)