微管活化NF-κB通路在動態(tài)壓應(yīng)力調(diào)控髓核細(xì)胞Sox9基因和Ⅱ型膠原體外表達(dá)中的作用.pdf

1、椎間盤退變是一系列脊柱退變性疾病的基本病理基礎(chǔ)。椎間盤退變性疾病是臨床常見的嚴(yán)重危害人群健康的疾病,其往往會導(dǎo)致繼發(fā)的椎管狹窄、脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成、腰腿痛及椎間盤突出造成的神經(jīng)根和脊髓壓迫，臨床多見且病情復(fù)雜，影響患者的基本生活和生產(chǎn)勞動，甚至導(dǎo)致不同程度的殘疾，造成勞動力喪失，給患者造成巨大痛苦，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。退變導(dǎo)致相關(guān)疾病的治療是臨床醫(yī)師所面臨的一大難題。一般認(rèn)為椎間盤退變從20歲即開始，緩慢進(jìn)展，70歲時(shí)100％的人群

2、有間盤的退行性改變,但只是程度不同和臨床癥狀不同。調(diào)查表明,椎間盤退變導(dǎo)致的脊柱疾病帶來的醫(yī)療費(fèi)用與心臟病相當(dāng),高于糖尿病及腎臟疾病,但目前有限的治療方法如椎板減壓、椎間融合等高度侵入性手術(shù)并發(fā)癥較多且遠(yuǎn)期療效并不理想,并且這些治療方法也只是對癥治療，無法達(dá)到根治該類疾病的目的，并不能扭轉(zhuǎn)椎間盤退變過程。研究椎間盤退變的機(jī)制和逆轉(zhuǎn)方法是根治椎間盤退變性疾病的主要策略。
　　本課題旨在通過對導(dǎo)致椎間盤退變的應(yīng)力因素的動態(tài)觀察研究，通

3、過完整的分子生物學(xué)調(diào)控通路研究宏觀致病因素動態(tài)變化與微觀病理學(xué)改變的相互關(guān)系。本課題在報(bào)道了人體髓核細(xì)胞體外動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，利用課題組自行設(shè)計(jì)、研制的可用于不同細(xì)胞、不同壓力條件的細(xì)胞壓力培養(yǎng)的專用儀器裝置（已獲得國家專利，專利號：ZL200820030390.7）完成了人體髓核細(xì)胞最佳體外壓應(yīng)力刺激模型的建模工作，摸索并驗(yàn)證了人體髓核細(xì)胞體外動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)模型的最佳力學(xué)參數(shù)。本課題的目的在于建立實(shí)驗(yàn)室條件下的仿生的體外髓核

4、細(xì)胞壓應(yīng)力培養(yǎng)模型，系統(tǒng)的觀察動態(tài)壓應(yīng)力條件下的對人體髓核細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的影響作用；并通過完全仿生的髓核細(xì)胞壓力模型，采用激光共聚焦、原子力顯微鏡、RT-PCR、western-blot、siRNA技術(shù)和免疫組化方法，闡明細(xì)胞骨架改變與NF-κB活化的關(guān)系和作用；壓應(yīng)力條件下NF-κB活化狀態(tài)對髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，為該疾病的發(fā)病機(jī)理研究、生物治療及防治策略的制定提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本課題的第

5、一部分是動態(tài)壓應(yīng)力在人體髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)中的作用和人體髓核細(xì)胞體外動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)模型的建立。利用已經(jīng)成熟的髓核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人體髓核細(xì)胞，使用本課題組研制的壓力裝置對培養(yǎng)的髓核細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)壓應(yīng)力刺激培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)（IshiharaH,McNallyDS,UrbanJP,etal.Effectsofhydrostaticpressureonmatrixsynthesisindifferentregionsoftheinterverte

6、braldisk[J].JApplPhysiol,1996,80(3):839-846.）并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取1～10Mpa區(qū)間內(nèi)不同壓力參數(shù)研究其對髓核細(xì)胞的影響，確定最佳制模參數(shù)；選擇生長曲線變化明顯且合理的狀態(tài)作為動態(tài)壓應(yīng)力刺激培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)模型（最佳制模參數(shù)為2.5Mpa1Hz30min）。對不同力學(xué)環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，比較和分析動態(tài)壓應(yīng)力環(huán)境對體外培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞生長動力學(xué)的影響，了解不同強(qiáng)度動態(tài)壓應(yīng)力對

7、髓核細(xì)胞凋亡的作用：從生長速率、MTT攝取、最大生長密度、分裂指數(shù)和克隆形成率等方面對應(yīng)力刺激細(xì)胞模型進(jìn)行生長動力學(xué)檢測；流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞的活性狀態(tài)通過以上指標(biāo)的觀察和檢測，對不同力學(xué)環(huán)境對髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用進(jìn)行了初步評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：
　　1.髓核組織隨著隨著退變程度的增加，髓核組織逐漸喪失水分，含水量隨著退變程度的加重而逐漸減少，透明度隨著退變程度的加重逐漸降低
　　2.動態(tài)壓應(yīng)力刺激后的細(xì)胞傳代后的細(xì)胞貼壁時(shí)間

8、明顯縮短，一般于6h即可見大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，但細(xì)胞的胞突略長(圖2)。隨著代次的增加，髓核細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象。一般細(xì)胞從傳至第5代起，生長明顯趨緩，細(xì)胞分裂指數(shù)明顯低于3代細(xì)胞，從形態(tài)學(xué)角度觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突起明顯延長，逐漸趨向于梭形，胞質(zhì)逐漸減少，喪失折光性，形態(tài)逐漸類似于成纖維細(xì)胞樣。一般傳至第7代時(shí)出現(xiàn)生長停滯。
　　3.隨著加力強(qiáng)度的增加,髓核細(xì)胞生長速度和最大生長密度均呈逐漸下降趨勢，加力強(qiáng)度較之頻率的增加對

9、髓核細(xì)胞影響更加明顯，于傳代時(shí)即出現(xiàn)生長停滯。
　　4.人體髓核細(xì)胞體外動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞克隆形成率與加力強(qiáng)度呈非線性的相關(guān)，適度的動態(tài)壓應(yīng)力刺激促進(jìn)細(xì)胞分裂生長，反之對細(xì)胞的分裂生長以及功能代謝呈阻礙作用，甚至加速細(xì)胞死亡以及凋亡的進(jìn)程。
　　5.各實(shí)驗(yàn)組在不同的動態(tài)壓應(yīng)力刺激下，1Mpa組與常壓對照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng)應(yīng)力強(qiáng)度大于5Mpa時(shí)，細(xì)胞各生長動力學(xué)指標(biāo)均明顯低于常壓對照組；2.5Mpa組與

10、常壓對照組和其他各實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞分裂指數(shù)等細(xì)胞生長動力學(xué)指標(biāo)的比較中具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明該壓力值對于促進(jìn)髓核細(xì)胞體外生長和代謝功能具有明顯作用，符合制模最佳參數(shù)基本要求。
　　本課題的第二部分是動態(tài)壓應(yīng)力環(huán)境下體外培養(yǎng)人體髓核細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)改變對NF-κB通路的活化作用。實(shí)驗(yàn)通過研究體外培養(yǎng)人體髓核細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)在動態(tài)壓應(yīng)力作用下的形態(tài)學(xué)改變初步闡明了動態(tài)壓應(yīng)力對人體髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)模型微管結(jié)構(gòu)的作用和影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)2.5Mpa

11、動態(tài)壓應(yīng)力作用后的髓核細(xì)胞在高倍鏡下可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化明顯，未見明顯細(xì)胞死亡，24小時(shí)后細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)；其余各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化明顯，死亡細(xì)胞較多，24小時(shí)后細(xì)胞結(jié)構(gòu)無恢復(fù)。經(jīng)微管阻斷劑預(yù)處理的髓核細(xì)胞經(jīng)過加力作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，β-tubulin染色熒光亮度值明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組。EMAS、RT-PCR和western-blot結(jié)果顯示2.5Mpa動態(tài)壓應(yīng)力作用后的人體髓核細(xì)胞NF-κB基因和蛋白的表達(dá)量均高于對照組和其他

12、各實(shí)驗(yàn)組。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：
　　1.動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)具有顯著的活化作用；不同強(qiáng)度的動態(tài)壓應(yīng)力對髓核細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的活化作用不同；髓核細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)活化狀態(tài)與動態(tài)壓應(yīng)力的強(qiáng)度呈非線性對應(yīng)關(guān)系，2.5Mpa1Hz的動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的人體髓核細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)具有最佳活化效果，當(dāng)力的強(qiáng)度大于5Mpa時(shí)對于微管結(jié)構(gòu)的作用變?yōu)椴豢赡妗?br>　　2.不同強(qiáng)度的動態(tài)壓應(yīng)力對人體髓核細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的活化狀態(tài)與NF-κB基因

13、和蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3.阻斷微管結(jié)構(gòu)后，動態(tài)壓應(yīng)力對髓核細(xì)胞的作用效果受到影響：微管結(jié)構(gòu)變化不明顯，NF-κB基因和蛋白的表達(dá)量均低于對照組和各實(shí)驗(yàn)組。
　　4.不同強(qiáng)度的動態(tài)壓應(yīng)力通過改變?nèi)梭w髓核細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)活化狀態(tài)調(diào)節(jié)NF-κB基因和蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控NF-κB下游基因和蛋白的目的。
　　本實(shí)驗(yàn)的第三部分是體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞在動態(tài)壓應(yīng)力作用下NF-κB活化對Sox9基因和II型膠原基因表達(dá)的

14、調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)通過采取RNA干擾技術(shù)，經(jīng)過病毒載體構(gòu)建、體外篩靶實(shí)驗(yàn)、內(nèi)源驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)手段對體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的NF-κB基因的有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證，構(gòu)建pFU-GW-RNAi對NF-κB基因進(jìn)行了抑制，同時(shí)通過RT-PCR和western免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法對下游的Sox9基因和II型膠原基因的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人髓核細(xì)胞中基因序列中存在多個(gè)有效的的病毒干擾靶點(diǎn)，選擇后作為后繼慢病毒包裝靶點(diǎn)進(jìn)行大量病毒包裝后感染髓

15、核細(xì)胞，檢測下游Sox9基因和II型膠原基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，NF-κB經(jīng)過siRNA作用后Sox9基因和II型膠原基因呈現(xiàn)顯著的表達(dá)降低。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：
　　1.人體髓核細(xì)胞的NF-κB基因存在多個(gè)可被敲減的基因作用靶點(diǎn)。
　　2.體外培養(yǎng)的人體髓核細(xì)胞在動態(tài)壓應(yīng)力作用下，NF-κB通道的活化對Sox9基因和II型膠原基因具有正向相關(guān)調(diào)控作用。
　　3.體外培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞NF-κB基因經(jīng)過siRNA作用后，So

16、x9基因和II型膠原基因的表達(dá)量顯著降低。
　　本課題立足于我們既往的研究結(jié)果，著眼于宏觀病因?qū)W和微觀病理學(xué)改變的聯(lián)系，重點(diǎn)闡明動態(tài)壓應(yīng)力通過細(xì)胞骨架的改變活化NF-κB通路對椎間盤髓核細(xì)胞Sox9基因和II型膠原表達(dá)的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，有助于幫助我們深入了解椎間盤退變性疾病的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)而為該類疾病的分子生物學(xué)治療找到以NF-κB通路相關(guān)蛋白和Sox9基因?yàn)榛A(chǔ)的基因治療靶點(diǎn)。對于深入認(rèn)識該類疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理，制定防治策略