補骨脂素激活MAPK-NF-κB信號通路促進成骨細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的:
　　骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨骼疾病，可以導(dǎo)致骨的脆性增加和發(fā)生骨折。約50％的女性由于絕經(jīng)后雌激素缺乏可能會引起骨質(zhì)疏松癥。為了減少絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松引起的骨折，藥物治療在于增加骨形成或減少骨吸收。目前的藥物在減少骨折發(fā)生的同時也有一定的副作用，研究者力圖尋找沒有不良反應(yīng)的具有選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)優(yōu)點的自然替代物。最近的研究表明，植物雌激素是治療骨質(zhì)疏松癥理想的天然選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。補骨脂素是中草藥補

2、骨脂的主要活性成分，作為一種植物雌激素用于治療骨質(zhì)疏松癥。一些研究已證實補骨脂素在成骨中的作用，然而，補骨脂素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成骨的通路和潛在的分子機制尚不明確。我們在體外用補骨脂素處理hFOB1.19（成骨細(xì)胞），明確補骨脂素對成骨細(xì)胞的作用和涉及的信號通路。
　　方法:
　　(1)補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞的作用:hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基加入一系列不同濃度的補骨脂素，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。CCK8檢測細(xì)胞活力，qP

3、CR和Westernblotting檢測GLUT3的表達水平，確定補骨脂素處理hFOB1.19細(xì)胞的濃度和時間。
　　(2)補骨脂素對MAPK信號通路研究:實驗分為五組:正常組、補骨脂素組（hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨脂素）、p38信號通路抑制劑SB203580組（hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨脂素和p38信號通路抑制劑SB203580）、ERK信號通路抑制劑SCH772984組（hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨

4、脂素和ERK信號通路抑制劑SCH772984）和JNK信號通路抑制劑SP600125組（hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨脂素和JNK信號通路抑制劑SP600125）。培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，CCK8檢測細(xì)胞的增值能力，提取總蛋白，Western blotting檢測各組p38、ERK1/2、JNK蛋白磷酸化水平以及p65、GLUT3的表達水平。
　　(3)補骨脂素對NF-kB信號通路的研究:實驗分為三組:正常組、補骨脂素組（hF

5、OB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨脂素）、NF-kB信號通路抑制組(hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入補骨脂素和NF-kB信號通路抑制)。培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，CCK8檢測細(xì)胞的增值能力，提取總蛋白，Western blotting檢測p65、GLUT3的表達水平。
　　結(jié)果:
　　(1)補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞有增殖作用:CCK-8檢測表明，hFOB1.19細(xì)胞在15μM補骨脂素下存在明顯的依賴作用，qPCR及Weste

6、rn blotting檢測15μM濃度下補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞的GLUT3的表達最明顯，與CCK-8檢測結(jié)果一致。補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞增殖最佳時間點，本研究通過CCK-8檢測表明，48h內(nèi)15μM濃度下補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞有明顯增殖作用，72h后細(xì)胞數(shù)量開始減少，qPCR和Western blotting檢測48h時補骨脂素對hFOB1.19細(xì)胞的GLUT3的表達最明顯，與CCK-8檢測結(jié)果一致(P＜0.05

7、)。
　　(2)補骨脂素可激活MAPK信號通路:hOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基中加入15μM補骨脂素作用下，再分別進行SCH772984、SB203580、SP600125處理后提取ERK、P38、JNK以及GLUT3的蛋白。Western blotting檢測表明，ERK、P38、JNK蛋白水平在三個組別里面沒有明顯的差異性;與單獨加補骨脂組相比較，在加入抑制劑后，ERK、P38、JNK蛋白的磷酸化水平以及p65和GLUT3蛋白水平顯

8、著降低。CCK-8檢測表明，MAPK抑制劑可顯著抑制補骨脂素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
　　(3)補骨脂素可激活NF-kB信號通路:hOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)基加入15μM補骨脂素作用下，NF-kB抑制劑(PDTC)處理后提取p65和GLUT3的蛋白。Western blotting檢測表明，與單獨加補骨脂組相比較，加入NF-kB抑制劑(PDTC)組的p65和GLUT3蛋白水平顯著降低。CCK-8檢測表明，NF-kB抑制劑(P