漢黃芩素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的脊髓背根神經(jīng)元炎癥反應(yīng)中MAPK-NF-κB信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)性疼痛是一組由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能障礙引起的慢性疼痛綜合征，臨床上病人常有自發(fā)疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏等不適，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。目前治療神經(jīng)性疼痛的藥物臨床治療效果不佳且副作用明顯，因此，從天然藥物中尋找有效的神經(jīng)性疼痛的治療，或許能為此類(lèi)治療提供新的途徑。漢黃芩素（Wogonin）作為天然的黃芩黃酮類(lèi)化合物，已證明在治療炎癥疾病方面有益，但對(duì)于脊髓背根（Dorsal root ganglion，DRG）

2、神經(jīng)元中的神經(jīng)炎性疼痛的干預(yù)尚未有研究。本實(shí)驗(yàn)首先分離大鼠 DRG神經(jīng)元，建立脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎癥反應(yīng)模型，確定LPS溶液的最佳濃度和作用時(shí)間，進(jìn)而通過(guò)漢黃芩素處理，體外觀察其對(duì)TLR4表達(dá)（TLR4 mRNA和TLR4蛋白水平）及下游通路（TLR4下游銜接分子MyD88、TAK1水平）的影響，并進(jìn)一步探討漢黃芩素對(duì)下游MAPK和NF-κB信號(hào)通路及重要炎癥因子的影響，為臨床治療

3、神經(jīng)炎性疼痛提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.選用健康雄性Wistar大鼠，擊后腦致昏后，斷頭處死，取胸段脊柱，急性分離DRG神經(jīng)元后培養(yǎng)和純化，用LDS構(gòu)建神經(jīng)炎性反應(yīng)模型，RT-qPCR檢測(cè)DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA的表達(dá)量，確定最佳濃度和作用時(shí)間。
　　2. LPS誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)后，不同濃度漢黃芩素處理，并設(shè)VIPER做陽(yáng)性對(duì)照以及未做任何處理的DRG神經(jīng)元做陰性對(duì)照，分別用RT-qPCR、

4、western blot檢測(cè)DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA和TLR4蛋白的變化情況，確定最佳濃度。
　　3. LPS誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)，適宜濃度漢黃芩素處理，并設(shè)VIPER做陽(yáng)性對(duì)照以及未做任何處理的DRG神經(jīng)元做陰性對(duì)照，Western blot檢測(cè)DRG神經(jīng)元中MyD88和TAK1的變化情況；CO-IP檢測(cè)TLR4與MyD88和TAK1配體的關(guān)聯(lián)；western blot檢測(cè)NK/p-JNK、ERK1/2/p-ERK1

5、/2和p38/p-p38蛋白的變化情況；RT-qPCR檢測(cè)NF-κB p65 DNA和western blot檢測(cè)IκK/p-IκK；ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和western blot檢測(cè)COX-2、iNOS的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、在體外條件下，LPS能誘導(dǎo)成功構(gòu)建DRG神經(jīng)元的炎癥損傷模型。在DRG神經(jīng)元中，LPS誘導(dǎo)的TLR4 mRNA的表達(dá)有濃度和時(shí)間依賴(lài)性，隨著濃度的增加，DR

6、G神經(jīng)元上的TLR4 mRNA的表達(dá)量逐漸上升，在LPS為10ng/ml的溶液中TLR4 mRNA的表達(dá)量最大；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DRG神經(jīng)元中的TLR4 mRNA表達(dá)量逐漸增加，在LPS為10ng/ml的溶液中培養(yǎng)時(shí)間為90min時(shí)TLR4 mRNA表達(dá)量最大。
　　2、不同劑量漢黃芩素對(duì)TLR表達(dá)4的影響：LPS能誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA、TLR4蛋白的表達(dá)，而予漢黃芩素處理后，TLR4 mRNA和TLR4蛋白的

7、表達(dá)均降低，且當(dāng)漢黃芩素為25μM時(shí)，DRG神經(jīng)元中的TLR4 mRNA表達(dá)最低，低于VIPER組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；當(dāng)漢黃芩素為100μM時(shí)，DRG神經(jīng)元中的TLR4蛋白表達(dá)量最低，但與VIPER組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明漢黃芩素可以部分減弱LPS誘導(dǎo)的TLR4 mRNA和TLR4蛋白表達(dá)，且具有濃度依賴(lài)性。
　　3、漢黃芩素對(duì)TLR4-MyD88-TAK1信號(hào)通路的影響：與CT組相比，LPS組

8、給予內(nèi)毒素刺激DRG神經(jīng)元后TLR4 mRNA和TLR4、MyD88和p-TAK1表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與LPS組相比，漢黃芩素與VIPER處理后TLR4 mRNA、TLR4、MyD88和p-TAK1蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），但二者使其下降的程度組間比較均無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　與CT組相比，LDS刺激DRG神經(jīng)元后能引起TLR4/MyD88和TLR4/TAK1復(fù)合物的顯著增加

9、（P＜0.05）；而予以漢黃芩素和VIPER處理后，相比于LSD組，兩種復(fù)合物均明顯減少（P＜0.05）；但二者使二種復(fù)合物增加的程度均無(wú)無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。同樣的，反向共免疫使用MyD88抗體檢測(cè)TLR4/MyD88復(fù)合物，漢黃芩素組和VIPER組TLR4表達(dá)也較LPS誘導(dǎo)組明顯降低（P＜0.05）。說(shuō)明漢黃芩素能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)中TLR4與MyD88和TAK1的相互作用，減輕炎癥反應(yīng)。

10、>　　4、漢黃芩素對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響：與CT組相比，LPS刺激DRG神經(jīng)元后可使NK/p-JNK、ERK1/2/p-ERK1/2和p38/p-p38蛋白表達(dá)量均顯著增加（P＜0.05）。而予以漢黃芩素和VIPER處理后，相比于LSD組，p-JNK、p-ERK1/2和p-p38蛋白表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但二者對(duì)三種蛋白磷酸化的降低程度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明漢黃芩素與VIPER一樣，

11、能夠明顯降低JNK、ERK1/2和p38蛋白的活性，抑制LPS誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)中MAPK信號(hào)通路。
　　5、漢黃芩素對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響：與CT組相比，LPS組DRG神經(jīng)元中的NF-κB p65DNA、p-IκK表達(dá)量明顯增加，而IκK的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05)；與LPS組相比，漢黃芩素和VIPER能明顯減少DRG神經(jīng)元中的NF-κB p65 DNA和p-IκK表達(dá)量，而IκK的表達(dá)量則明顯降低（P＜0.05

12、)；但漢黃芩素組與VIPERL組的NF-κB p65DNA、IκK、p-IκK表達(dá)量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。說(shuō)明漢黃芩素降低 LDS誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)中NF-κB的活性，減弱NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路的作用。
　　6、漢黃芩素對(duì)炎癥因子的影響：與CT組相比，LPS組DRG神經(jīng)元中的IL-1β、TNF-α、L-6、COX-2和iNOS表達(dá)量明顯增加（P＜0.05)；與LPS組相比，漢黃芩素和VIPER能明顯

13、減少DRG神經(jīng)元中的IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS表達(dá)量（P＜0.05)；但漢黃芩素組與VIPERL組的五種炎癥因子的表達(dá)量組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。說(shuō)明漢黃芩素能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎性反應(yīng)中重要炎癥因子的表達(dá)，具有抗炎作用。
　　結(jié)論：
　　在LPS誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元炎癥反應(yīng)中，漢黃芩素通過(guò)抑制TLR4-MyD88-TAK1信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)銜接蛋白MyD88和T