酵母雙雜交技術(shù)鑒定FAT10新的結(jié)合蛋白-真核翻譯延伸因子--1a1.pdf

1、目的：本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選類泛素基因FAT10的相互作用蛋白，明確FAT10在肝癌細(xì)胞Hep3B中相互作用的蛋白，為探討FAT10蛋白在肝癌發(fā)生中的作用機制提供依據(jù)。
　　方法：一、利用clontech的cDNA文庫構(gòu)建系統(tǒng)構(gòu)建類泛素FAT10高表達(dá)肝癌細(xì)胞株Hep3B的酵母雙雜交用cDNA文庫；并構(gòu)建“誘餌”質(zhì)粒。二、利用clontech GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人肝癌細(xì)胞系Hep3B的cDNA文庫，以獲得與類泛素蛋白

2、FAT10相互作用的蛋白分子，再通過回交試驗進(jìn)行初步驗證。三、利用免疫共沉淀和激光共聚焦細(xì)胞內(nèi)共定位試驗進(jìn)一步驗證FAT10和篩選蛋白之間存在相互作用。四、通過RNA干擾降低FAT10表達(dá)觀察eEF1A1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：一、成功合成雙鏈cDNA，均符合建庫要求；庫容量達(dá)到1.03×106克隆，原始文庫滴度為2.50×106 cfu/mL，擴增后的文庫滴度為3.60×109 cfu/mL.插入片段大小分布為0.5-3.5 k

3、b，平均長度約為2.0 kb，完全滿足后續(xù)的酵母雙雜交研究。并成功構(gòu)建“誘餌”質(zhì)粒pGBK7/FAT10。二、首先證實“誘餌”質(zhì)粒pGBK7/FAT10無自激活特性。通過酵母雙雜交篩選出陽性克隆后測序證實有一基因eEF1A1(GenBank accession No.NM_001402.5)，編碼蛋白eEF1A1；通過回交實驗表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7/FAT10在酵母中能與eEF1A1相互作用。三、免疫共沉淀檢測證明FAT10和eEF1

4、AI存在相互作用。然后通過激光共聚焦觀察到FAT10和eEF1A1之間存在共定位。四、通過RNA干擾降低肝癌細(xì)胞株Hep3B和MHCC97H細(xì)胞的表達(dá)，觀察到在通過RNA干擾降低FAT10的mRNA和蛋白表達(dá)后同時伴隨著eEF1A1的mRNA和蛋白表達(dá)降低，這進(jìn)一步證實了FAT10和eEF1AI之間存在調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)論：我們的研究首次證明eEF1A1蛋白是FAT10在發(fā)揮調(diào)節(jié)功能過程中新的作用底物；并且通過降低FAT10的表達(dá)