構(gòu)建人α-防御素HNP-1成熟肽酵母雙雜交系統(tǒng)及鑒定.pdf

1、[目的] 構(gòu)建人α-防御素HNP-1成熟肽酵母雙雜交系統(tǒng)，以期為鑒定出α-防御素與肺上皮細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)蛋白分子打下基礎(chǔ)。 [方法] 培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，提取RNA，RT-PCR擴(kuò)增防御素HNP-1成熟肽的cDNA片段，克隆入pBluescript-SK-Ⅱ質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。EeoR Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切pBluescript-SK-Ⅱ-HNP-1和酵母表達(dá)載體pGBKT7，回收產(chǎn)物并連接，重組誘餌質(zhì)粒命名為pGBKT7-HNP-1

2、，酶切測(cè)序檢測(cè)。用醋酸鋰法將重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，在SD/Trp<'->，SD/Ade<'->/，Trp<'->，SD/His<'->/Trp<'->)，SD/Leu<'->/Trp<'->缺陷性培養(yǎng)基上觀察pGBKT7-HNP-1在AHl09中的表達(dá)情況，檢測(cè)誘餌蛋白有無(wú)毒性作用和自激活功能。磁珠法提取人肺上皮細(xì)胞A549mRNA，用SMART技術(shù)，經(jīng)LD-PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)ds cDNA，轉(zhuǎn)入酵母菌Y187構(gòu)建A549細(xì)

3、胞cDNA文庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行文庫(kù)滴定和雜交效率測(cè)定。將pGBKT7-HNP-1，人A549細(xì)胞ds eDNA及文庫(kù)質(zhì)粒pGART7/Rec<'->順序轉(zhuǎn)化酵母菌AHl09，β-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)以及氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)雙重篩選陽(yáng)性克隆。然后用文庫(kù)引物進(jìn)行菌落PCR對(duì)候選陽(yáng)性克隆進(jìn)行初步鑒定。 [結(jié)果] 克隆的重組質(zhì)粒pBluescript-SK-Ⅱ-HNP-1，以及亞克隆的重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HNP-1經(jīng)測(cè)序鑒定證明其插入片段序

4、列完全正確。pGBKT7-HNP-1轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH109，在SD/Trp<'->板上生長(zhǎng)良好，在SD/Ade<'->/Trp<'->，SD/His<'->/Trp<'->，SD/Leu<'->/Trp<'->平板上不能生長(zhǎng)，且在SD/Trp<'->液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后，OD600值達(dá)到系統(tǒng)要求。說(shuō)明誘餌蛋白對(duì)酵母菌株AH109不具有毒性，且不具自主激活報(bào)告基因的功能。所構(gòu)建的A549細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，庫(kù)容量為1.7×10<'6