酵母雙雜交鑒定TCTP與Rheb相互作用關(guān)系并驗證其功能.pdf

1、翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TC TP)是真核生物中廣泛表達的一種保守的蛋白，結(jié)構(gòu)上與Mss4（磷脂酰肌醇激酶）蛋白相似，在維持細胞正常生理功能中起著重要作用。Rheb(Ras homolog enriched inbrain)是Ras超家族的小GTP酶，有Rheb-GDP和Rheb-GTP兩種形式，是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of

2、rapamycin，mTOR)信號通路的上游正調(diào)控因子，與mTOR信號通路共同調(diào)控著細胞生長、增殖和分化等過程。有報道顯示TCTP可能是Rheb的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，使得Rheb從無活性的GDP形式轉(zhuǎn)換為有活性的GTP形式，但這一功能目前尚不能確定。本研究以內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞(GFb)為材料，探討TCTP和Rheb之間的相互作用關(guān)系，并對TCTP的功能進行初步研究。
　　實驗首先利用RT-PCR克隆絨山羊TC

3、TP基因的cDNA，分析其表達特性;然后利用免疫共沉淀和Western-Blot鑒定免疫沉淀復合物中TCTP和Rheb的共同存在，證明二者的相互作用關(guān)系;接著構(gòu)建TCTP基因和Rheb基因的酵母雙雜交誘餌載體和靶載體，轉(zhuǎn)化酵母菌，利用酵母雙雜交技術(shù)進一步確定二者間的直接作用關(guān)系;最后構(gòu)建TCTP過表達和RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染GFb細胞，利用Western-Blot檢測總蛋白中mTOR信號通路效應分子mTOR、S6的表達量及磷酸化情況，確定

4、TCTP是否參與了mTOR信號通路的調(diào)控，再利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，明確TCTP是否具有調(diào)控細胞周期的功能。
　　絨山羊TCTP基因ORF全長519 bp，編碼172個氨基酸殘基，該基因在肝臟中表達量較高，在腦中表達量較低。免疫共沉淀檢測到TCTP與Rheb具有相互作用。進一步的酵母雙雜交鑒定表明二者具有直接的相互作用。TCTP過表達和轉(zhuǎn)錄后沉默TCTP基因顯著影響mTOR和S6的表達，但對其磷酸化水平無影響。流式細胞術(shù)檢測結(jié)