1.人睪丸特異核孔蛋白bs63的功能研究;2.應(yīng)用酵母雙雜交尋找hsd1編碼蛋白(hsmp1)的結(jié)合物

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文1.人睪丸特異核孔蛋白BS-63的功能研究;2.應(yīng)用酵母雙雜交尋找HSD-1編碼蛋白(hSMP-1)的結(jié)合物姓名：才迎申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)指導(dǎo)教師：繆時英;王琳芳2002.4.23中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博l ：畢業(yè)論文 摘要酸拉鏈及一個谷氨酰胺富含區(qū)。相關(guān)工作表明，A F l 0 的小鼠同源物A l l 0 在睪丸組織中有最高量的表達(dá)，A l l 0 蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)?！巍癁榱蓑?/p>

2、證B s 一6 3 與T r a n s p o r t i n 、R a n 、A F l 0 的相互作用，我們首先將在酵母雙雜交系統(tǒng)中與B s ．6 31 ．6 K 作用的R a n ( 1 ．2 1 6 氨基酸) 、T r a n s p o r t i n ( 1 - 2 8 8 氨基酸) 、A F l 0 ( 6 9 6 —1 0 0 1 氨基酸) 分別表達(dá)為融合蛋白G S T - T r a n s p o r t i n

3、、G S T - R a n 、G S T - A F l 0 ，以谷胱苷肽一s 一轉(zhuǎn)移酶( G S T ) 標(biāo)記進(jìn)行親和純化。以純化的G S T - T r a n s p o r t i n 、G S T - A F l 0 蛋白免疫新西蘭白兔獲得相應(yīng)的多克隆抗體。j 7為進(jìn)一步確證B S 一6 3 蛋白與R a n 、T r a n s p o r t i n 、A F l 0 作用的活性區(qū)域，我們將B s - 6 3 蛋白分成不

4、同的結(jié)構(gòu)域采用酵母雙雜交系統(tǒng)來研究／結(jié)果表明B s 一6 3 與R a n 、T r a n s p o r t i n 的結(jié)合必須要有一個完整的R a n 結(jié)合結(jié)構(gòu)域( R a nB i n d i n gD o m a i n ，R a n B D ) 。進(jìn)一步P u l l ．d o w n 結(jié)合W e s t e r n b l o t 實驗證明，T r a n s p o r t i n 確可與含有完整R a n B D 的B

5、 S 一6 3 0 ．6 K 片段編碼蛋白在體外相結(jié)合。再采用表面質(zhì)子共振( S u r f a c eP l a s m o n R e s o n a n c e ，S P R ) 技術(shù)證實兩者的結(jié)合速率常數(shù)K 。。為1 ．0 5 4 5 6 ×1 0 6 M - 1 s ～，解離速率常數(shù)K 拈：為O ．0 4 3 8 0 2S ～，標(biāo)志其結(jié)合強弱的解離平衡常數(shù)K D 為4 ．1 5 ×1 0“M ，一般表示有生

6、理意義兩種蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合其K D 小于1 0 _ 6 M ，K D 小于1 0 _ 8 M表示睪丸特異的核孔蛋白B s 一6 30 ．6 K 這一區(qū)域的編碼蛋白質(zhì)與T r a n s p o r t i n 有著較強的結(jié)合。在酵母中的實驗表明，B S ．6 3 與A F l 0 的結(jié)合則必須要有B s 一6 3C 末端與N u p 3 5 8 完全不同、睪丸特異的肽段參與，而且此肽段要保持一個相對完整的結(jié)構(gòu)。運用S P R 技術(shù)結(jié)合

7、W e s t e r n b l o t 證實生精細(xì)胞抽提液中的B S 一6 3 與A F l 0 可在體外結(jié)合。以上結(jié)果提示，在睪丸組織中大量表達(dá)的A F l 0 可能是睪丸特異的核孔蛋白B S ．6 3的特異轉(zhuǎn)運物。由此我們推論，R a n 與T r a n s p o r t i n 是人睪丸特異的核孔蛋白B S 一6 3發(fā)揮核、質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的配體作用蛋白，輔助其將細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運物向核內(nèi)轉(zhuǎn)運。A F l 0則為B S ．6 3 在

8、睪丸組織中特異的轉(zhuǎn)運物，從細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，調(diào)節(jié)生精細(xì)胞向精子的轉(zhuǎn)變。／“耳墨旦：! 基因是本實驗組用不孕婦女血清篩選人睪丸1 g t l l c D N A 表達(dá)文庫獲得的一個新基因。H S D 一1 全長2 4 8 2 b p ，開放閱讀框1 5 7 2 b p ，編碼5 2 3 個氨基酸，編碼蛋白命名為h S M P ．1 。免疫熒光定位實驗證明h S M P ．1 位于人精子頭部。N o r t h e r nb l o t顯