絲素蛋白仿生支架調(diào)控嗅鞘細(xì)胞生物學(xué)行為.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)不可避免造成神經(jīng)元死亡及其軸突斷裂,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)支配功能的喪失。支持和引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)是SCI修復(fù)的關(guān)鍵。作為支持和引導(dǎo)損傷神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的移植細(xì)胞,嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)具有天然的優(yōu)勢(shì)。然而,SCI后膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的抑制分子形成抑制軸突再生的化學(xué)屏障,膠質(zhì)細(xì)胞活化遷移在損傷部位形成的膠質(zhì)瘢痕和空洞缺損成為軸突再生的物理屏障。在此環(huán)境

2、中,移植細(xì)胞難以定向遷移和有序分布,無法為再生軸突提供有效的支持和引導(dǎo),這是細(xì)胞移植修復(fù)SCI難以取得突破的重要原因。因此,通過組織工程構(gòu)建仿生支架定向分布移植細(xì)胞,克服損傷部位抑制分子和瘢痕空洞對(duì)軸突再生的不利影響,為神經(jīng)元軸突再生提供支持和引導(dǎo),成為實(shí)現(xiàn)SCI功能修復(fù)的重要突破口,也是目前SCI修復(fù)的研究熱點(diǎn)。
　　選擇性能優(yōu)異的生物材料是研究的前提。絲素蛋白(silk fibroin, SF)以其優(yōu)異的生物相容性、良好的力學(xué)

3、性能、可控的降解和可塑性能逐漸被研究者認(rèn)知。支架仿生構(gòu)建關(guān)鍵在于對(duì)基質(zhì)材料納米結(jié)構(gòu)的調(diào)控。近年來,SF的自組裝機(jī)制和納米結(jié)構(gòu)調(diào)控研究取得重大進(jìn)展。基于SF自組裝機(jī)制的研究,本項(xiàng)目組獲得結(jié)構(gòu)均一的納米線結(jié)構(gòu)單元,發(fā)現(xiàn)該納米線結(jié)構(gòu)對(duì)SF靜電紡絲過程的纖維直徑及走向具有重要影響,可以使得SF納米纖維的直徑更為可控、取向更為有序。因此,作為組織工程支架的基質(zhì)材料,SF具有天然的優(yōu)勢(shì)。
　　為探討SF納米纖維材料作為定向分布OECs的移植載

4、體的可行性,本課題就以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行探討:(1)建立OEC培養(yǎng)體系,倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞形態(tài)的變化,活細(xì)胞工作站觀察OECs連續(xù)動(dòng)態(tài)的形態(tài)變化,明確同一培養(yǎng)條件下 OECs遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律。(2)研究不同培養(yǎng)條件(有或無血清,不同增殖劑:Forskolin或bFGF)對(duì)OECs的形態(tài)及其遷移能力的影響,明確不同培養(yǎng)條件下OECs遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律,分析OECs遷移的調(diào)控機(jī)制。(3)靜電紡絲工藝制

5、備桑蠶絲(BSF)和柞蠶絲(TSF)納米纖維支架,檢測(cè)比較并評(píng)價(jià)兩種支架材料對(duì)OECs的形態(tài)、增殖、存活及其表型的影響,明確SF納米纖維支架的生物相容性及其優(yōu)越性的具體體現(xiàn)。(4)掃描電鏡觀察SF支架及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及其分布,免疫熒光染色顯示細(xì)胞表型及細(xì)胞骨架的發(fā)育,活細(xì)胞工作站連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)特征,明確其變化規(guī)律,分析細(xì)胞遷移軌跡、遷移速度、遷移速率等,研究靜電紡SF納米纖維支架的不同種類(TSF與BSF)、

6、不同直徑(400nm和1200nm)和不同取向分布(平行有序排列和無序網(wǎng)絡(luò)狀)及空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)OECs遷移運(yùn)動(dòng)的影響,明確SF納米纖維支架定向分布OECs的調(diào)控作用及其機(jī)制。(5)RT-PCR檢測(cè)OECs的MBP、NGF、GDNF、BDNF、NCAM、VEGF的基因表達(dá),ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的蛋白含量,明確SF納米纖維定向分布的OECs表達(dá)功能基因和蛋白量的變化,分析其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能。(6)探討SF納米纖維定向分布OECs對(duì)神經(jīng)元生

7、長(zhǎng)發(fā)育的影響,明確定向分布OECs的生物學(xué)功能,為進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)及其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過上述研究,本課題得出如下結(jié)論,并分析其原因、意義及啟示:
　　(1)通過活細(xì)胞工作站連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),在同一培養(yǎng)條件下,OECs遷移過程中表現(xiàn)出多樣性變化的形態(tài)特征。分析細(xì)胞形態(tài)變化與遷移運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)系,明確OECs多樣性的形態(tài)表現(xiàn)是由其功能狀態(tài)決定的,不同形態(tài)的OECs適應(yīng)不同的功能狀態(tài):細(xì)長(zhǎng)突起及梭形胞體形態(tài)有利于細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng),

8、扁平狀有利于胞體鋪展黏附,圓球狀有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。OECs遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律更加合理地解釋OECs的形態(tài)多樣性。在電鏡、光鏡和免疫染色觀察細(xì)胞的形態(tài)都是相對(duì)靜止和固定的,因而難以區(qū)分和正確理解細(xì)胞形態(tài)的多樣性是由于細(xì)胞適應(yīng)其自身功能需要而形變的結(jié)果。進(jìn)一步明確OECs形態(tài)變化與遷移運(yùn)動(dòng)功能之間的相互關(guān)系有助于理解OECs遷移的調(diào)控機(jī)制。
　　(2)通過研究不同培養(yǎng)條件對(duì)OECs的形態(tài)及其遷移能力的影響,明確OECs具

9、有優(yōu)異的可塑性。OECs自胞體伸出微小突起感知周圍環(huán)境信號(hào)變化,從而改變自身形態(tài)以適應(yīng)環(huán)境變化,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞不同功能的表達(dá)。無血清條件培養(yǎng)液、Forskolin和bFGF有利于OECs運(yùn)動(dòng)功能的表達(dá),提高了細(xì)胞的遷移速度。由于OECs遷移缺乏有效引導(dǎo),遷移軌跡和遷移方向是隨機(jī)和無規(guī)律性的,呈現(xiàn)無規(guī)行走。實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的濃度梯度分布或是構(gòu)建模擬細(xì)胞外基質(zhì)三維納米空間結(jié)構(gòu)的仿生支架是體外引導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞定向遷移的有效途徑。
　　(3)SF

10、(尤其是TSF)納米纖維支架具有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)OECs黏附、生長(zhǎng)與增殖。分析原因:SF納米纖維支架高的表面與體積比率、表面活性和優(yōu)異的親水性能有利于支架材料吸附培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)分子和其它生物活性物質(zhì),從而促進(jìn)細(xì)胞在支架表面黏附,進(jìn)而有利于細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)與增殖。TSF納米纖維具有更為優(yōu)異的生物相容性,與其含有豐富的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列有關(guān),RGD序列是人類細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛存在的能夠被細(xì)胞表面受體識(shí)別和特

11、異性結(jié)合的序列,作為細(xì)胞膜整合素受體與細(xì)胞外配體相結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn),介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用,能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)支架的黏附,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。TSF富含RGD三肽的特性賦予其更為優(yōu)異的生物學(xué)性能。
　　(4)SF納米纖維的直徑、取向分布及空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)定向分布OECs的調(diào)控作用。OECs對(duì)BSF和TSF納米纖維的不同直徑大小、取向分布及三維空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在不同的生物學(xué)響應(yīng)。小直徑(400納米)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生

12、長(zhǎng)、增殖及遷移都有更為優(yōu)異的表現(xiàn)。分析原因:OECs依賴于其突起尋路及附著,其細(xì)小的突起更容易黏附于小直徑的納米纖維之上,進(jìn)而有利于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及遷移等生物學(xué)功能。平行排列的納米纖維有利于引導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞遷移軌跡和方向,細(xì)胞沿納米纖維的取向形成有序分布,在同一根纖維上,細(xì)胞間的突起相互連接從而細(xì)長(zhǎng)串珠樣結(jié)構(gòu)。分析原因:平行排列的納米纖維結(jié)構(gòu)能夠使細(xì)胞的突起在尋路過程中不易被其它纖維或細(xì)胞影響和干擾,因而在遷移過程中能夠保持較好的方

13、向性,引導(dǎo)細(xì)胞在支架材料上定向遷移并有序分布。從超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞在支架三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的狀態(tài),能夠提示支架的孔隙大小、纖維間的距離及排列方式對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及功能也有重要影響,這對(duì)于構(gòu)建體內(nèi)應(yīng)用的支架有著重要的啟示意義。目前SF納米纖維的直徑能夠控制在50納米級(jí)別,同時(shí)纖維取向分布更為有序,今后將更為深入探討纖維直徑、取向及三維空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)OECs生物學(xué)行為的影響,以進(jìn)一步優(yōu)化支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
　　(5)SF納米纖維調(diào)控OECs定向遷

14、移和有序分布與細(xì)胞骨架的排列方式密切相關(guān)。從細(xì)胞骨架形態(tài)及其分布的觀察可以看出,生長(zhǎng)在SF納米纖維上的OECs細(xì)胞骨架發(fā)育理想,微管蛋白排列整齊,表明細(xì)胞可以感受生長(zhǎng)環(huán)境,對(duì)SF納米纖維支架具有很好的反應(yīng),而且對(duì)小直徑平行排列的TSF納米纖維的反應(yīng)更強(qiáng)。同時(shí)提示,OECs對(duì)基質(zhì)環(huán)境的響應(yīng)是通過調(diào)控細(xì)胞骨架的形成及其架構(gòu),從而控制細(xì)胞的形態(tài)變化(如突起的延伸及回縮,胞體的形變),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移并控制細(xì)胞遷移的方向,引導(dǎo)細(xì)胞在支架材料上

15、形成有序分布。
　　(6)TSF納米纖維支架有利于OECs功能基因和蛋白的表達(dá)。TSF納米纖維支架為細(xì)胞提供的生長(zhǎng)環(huán)境有利于細(xì)胞合成與分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞黏附分子及可溶性趨化因子,使得細(xì)胞能夠在支架上遷移和相互聚集,細(xì)胞間形成更多的通訊聯(lián)接。同時(shí),TSF納米纖維支架促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用還可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。
　　(7)定向分布OECs支持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育,引導(dǎo)神經(jīng)元軸突延伸。支持和引導(dǎo)神經(jīng)元及其軸突的生

16、長(zhǎng)及延伸是OECs在體內(nèi)嗅覺神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育及損傷再生過程中作為細(xì)胞底物作用的關(guān)鍵,也是其應(yīng)用于移植修復(fù)SCI的重要理論基礎(chǔ)。體外構(gòu)建SF仿生支架定向分布OECs,支持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育,引導(dǎo)神經(jīng)元軸突延伸是本課題研究的目的,也是其研究?jī)r(jià)值的核心體現(xiàn)。
　　天然細(xì)胞外基質(zhì)的纖維尺寸為50-500nm,進(jìn)一步控制納米纖維的直徑及取向,最大程度地仿生體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是今后研究的重要內(nèi)容?；赟F自組裝機(jī)制研究的突破,具有天然細(xì)胞外基質(zhì)膠原