不同剛度三維脫細(xì)胞支架的制備及其對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：本文擬通過(guò)制備不同剛度的三維(three dimension,3D)脫細(xì)胞基質(zhì)(decellularized extracellular matrix,DECM)離體模擬人乳腺腫瘤組織微環(huán)境，探究基質(zhì)剛度對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231和細(xì)胞浸潤(rùn)等生物學(xué)行為的影響。
　　方法：構(gòu)建干擾和過(guò)表達(dá)賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)基因的慢病毒載體，并分別轉(zhuǎn)染乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量

2、多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)和免疫印跡(Western blot)檢測(cè)LOX mRNA與蛋白的表達(dá)。將表達(dá)不同量LOX的MDA-MB-231細(xì)胞注射裸鼠腋窩皮下，成瘤后經(jīng)脫細(xì)胞方法得到3D DECM支架，并使用材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)得其彈性模量。使用掃描電子顯微鏡觀察DECM顯微結(jié)構(gòu)。通過(guò)石蠟切片及組織學(xué)染色進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)(extracell

3、ular matrix,ECM)重要組分。在不同剛度DECM進(jìn)行再細(xì)胞化，利用Live/dead染色及MTS檢測(cè)1、4、7與10天的細(xì)胞活力，通過(guò)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色檢測(cè)再細(xì)胞化7天后細(xì)胞浸潤(rùn)。最后通過(guò)qPCR檢測(cè)再細(xì)胞7天后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)和轉(zhuǎn)錄因子(Snail1)以及I型膠原(col

4、lagen I)、纖連蛋白(fibronectin)與LOX mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：經(jīng)脫細(xì)胞法形成的不同剛度3D DECM完好保存了ECM組分與結(jié)構(gòu)，再細(xì)胞化實(shí)驗(yàn)表明這種不同剛度的3D DECM對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響。
　?、賟PCR與Western blot結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染干擾LOX慢病毒載體的MDA-MB-231細(xì)胞中LOX基因與蛋白的表達(dá)被顯著抑制，而過(guò)表達(dá)組中LOX表達(dá)量明

5、顯提升。
　　②組織學(xué)染色結(jié)果表明：各組DECM中細(xì)胞被完全脫去，而且完整保持了ECM結(jié)構(gòu)及膠原、糖胺聚糖等主要組分。
　　③掃描電子顯微鏡及力學(xué)性能測(cè)定結(jié)果表明：對(duì)照組DECM孔隙率為48.47±5.27％，剛度為3.24±0.39kPa；低剛度組的DECM孔隙率為增加為68.12±5.74%，剛度減小為2.57±0.26kPa；相反地，高剛度組的DECM孔隙率減小為32.68±4.30%，剛度增加為4.91±0.31kP

6、a。
　?、茉偌?xì)胞化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MDA-MB-231細(xì)胞可浸潤(rùn)至不同剛度的支架內(nèi)部并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　⑤qPCR結(jié)果表明：高剛度組脫細(xì)胞基質(zhì)促進(jìn)MDA-MB-231 LOX mRNA的表達(dá)；低剛度組脫細(xì)胞基質(zhì)促進(jìn)vimentin mRNA的表達(dá)，抑制fibronectin mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論：經(jīng)構(gòu)建的LOX過(guò)表達(dá)與干擾的慢病毒轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231中LOX基因和蛋白的表達(dá)水平能夠被有效調(diào)控，使得胞外