BRAFV600E突變聯(lián)合臨床及病理特征在PTC診斷、預(yù)后判斷及131I療效預(yù)測(cè)中的研究.pdf

1、近年來，甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)病率在全球呈“爆發(fā)式”增長，其中以甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Carcinoma，PTC）的發(fā)病率上升最為明顯。在給予包括手術(shù)、術(shù)后促甲狀腺激素（Thyroid Stimulating Hormone，TSH）抑制治療及131I內(nèi)照射治療的個(gè)體化綜合治療后，甲狀腺乳頭狀癌有著較好的預(yù)后，死亡率較低。但臨床中不乏局部轉(zhuǎn)移較早、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、131I治療效果差的高風(fēng)險(xiǎn)患者。如何盡早識(shí)別這部分患

2、者，明確甲狀腺乳頭狀癌的高危特征，對(duì)制定個(gè)體化的治療方案、建立正確的隨訪模式、提高乳頭狀癌患者的整體預(yù)后具有深遠(yuǎn)意義。
　　BRAFV600E突變是甲狀腺乳頭狀癌中最有意義的基因事件之一。BRAF蛋白是MAPK通路（RAS-RAF-MAK-ERK細(xì)胞信號(hào)途徑）上的一員，該基因突變導(dǎo)致BRAF蛋白持續(xù)激活，直接引起下游MEK蛋白的磷酸化，最終導(dǎo)致上述信號(hào)途徑持續(xù)激活，引起細(xì)胞過度增殖、分化及腫瘤的發(fā)生。較多研究結(jié)果提示：1.甲狀腺乳

3、頭狀癌中有著較高的 BRAFV600E突變率，約32％~73%。在甲狀腺良性腫瘤及其他病理類型的甲狀腺惡性腫瘤中并未發(fā)現(xiàn)該基因的突變，有著較高的診斷價(jià)值；2.伴有BRAFV600E突變的乳頭狀癌，侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、131I治療效果差、死亡率高。但近年來出現(xiàn)了許多相反的結(jié)論，認(rèn)為該突變與乳頭狀癌的侵襲性特征并無相關(guān)性，并且一些傳統(tǒng)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為“低風(fēng)險(xiǎn)”的乳頭狀癌同樣檢測(cè)到 BRAFV600E突變。BRAFV600E突變是否是影響甲狀

4、腺乳頭狀癌生物學(xué)行為的獨(dú)立因素，結(jié)論尚不統(tǒng)一。
　　研讀此類結(jié)果時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，絕大部分的研究重點(diǎn)在分析BRAFV600E突變與各種預(yù)后的影響因子之間的關(guān)系，而BRAFV600E突變率本身是否受臨床特征及組織病理特點(diǎn)的影響尚無廣泛研究。BRAFV600E突變對(duì)預(yù)后的判斷、131I治療效果的預(yù)測(cè)，是否會(huì)因臨床、病理特征的不同而有差異，結(jié)論也不得而知。
　　基于上述思路，我們?cè)趪鴥?nèi)較早開始綜合性分析BRAFV600E突變?cè)谂R床實(shí)際應(yīng)

5、用中的影響因素和價(jià)值。我們的研究首先探討影響甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E突變率的臨床特征，包括年齡、性別、術(shù)前甲狀腺血清學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，尋找影響B(tài)RAFV600E突變?cè)\斷意義的臨床特征；其次探討B(tài)RAFV600E突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌預(yù)后判斷中的提示意義，分析該突變與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯、MACIS評(píng)分、病理亞型及TNM分期的相關(guān)性，并研究臨床、組織病理特征對(duì)該相關(guān)性的影響；最后研究BRAFV600E突變對(duì)鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（the N

6、a+/I- Symporter，NIS）蛋白表達(dá)的影響，分析影響NIS蛋白表達(dá)的因素，間接討論該突變對(duì)131I治療效果的影響。通過以上研究，我們不僅探討B(tài)RAFV600E突變的獨(dú)立臨床意義，而且也進(jìn)一步結(jié)合臨床病理特征分析該突變，為甲狀腺乳頭狀癌臨床決策制定中的聯(lián)合應(yīng)用提供新的思路和依據(jù)。
　　第一部分BRAFV600E突變聯(lián)合臨床特征對(duì)PTC診斷的提示意義
　　目的：對(duì)比研究BRAFV600E突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌和良性腫瘤

7、中的差異，探討該基因突變與術(shù)前臨床特征的相互關(guān)系和相互影響。
　　方法：回顧性分析華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院甲乳外科2013年6月至2014年6月間同一手術(shù)組收治的甲狀腺乳頭狀癌及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病例，按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選病例。切取石蠟組織提取基因組DNA，RT-qPCR方法檢測(cè)BRAFV600E突變。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析BRAFV600E基因突變與臨床特征（年齡、性別、血清甲狀腺相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果）的相關(guān)性。
　　結(jié)果：共納入PTC134例

8、，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（NodularGoiter，NG）37例。1.PTC組BRAFV600E突變率為68.7%，NG組為0%；2. PTC組，BRAFV600E突變與年齡、術(shù)前血清甲狀腺球蛋白抗體水平（Tg-Ab）存在明顯相關(guān)性，與性別、TSH水平、游離甲狀腺素水平（FT4）、游離甲狀腺三碘原氨酸水平（FT3）、甲狀腺球蛋白水平（Tg）、甲狀腺過氧化物酶抗體水平（TPO-Ab）、促甲狀腺激素受體抗體水平（TSHR-Ab）無明顯相關(guān)性。3.

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析示，年齡＞38歲亞組的突變率明顯高于≤38歲亞組（OR=2.63,95%Cl=1.17,5.92 p=0.020）；結(jié)合臨床，術(shù)前血清Tg-Ab和TPO-Ab水平異常升高亞組的突變率明顯低于兩抗體正常亞組（OR=0.357,95%Cl=0.129,0.985，p=0.047;OR=0.333,95%Cl=0.129,0.86，p=0.023）。
　　結(jié)論：甲狀腺良性腫瘤中幾乎沒有BRAFV600E突變，當(dāng)檢測(cè)到突變時(shí)，診

10、斷為甲狀腺乳頭狀癌的可能性較大；對(duì)疑似惡性行BRAFV600E突變檢測(cè)，但未檢測(cè)到突變的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，如伴有突變率可能偏低的臨床特征（如年齡低于38歲、血清Tg-Ab和（或）TPO-Ab異常升高），應(yīng)建議進(jìn)一步手術(shù)或更加密切的隨訪。
　　第二部分BRAFV600E突變聯(lián)合臨床病理特點(diǎn)對(duì)PTC預(yù)后的提示意義
　　目的：研究BRAFV600E突變與PTC預(yù)后特征的相關(guān)性，探討臨床、組織病理特點(diǎn)對(duì)該相關(guān)性的影響。
　　方法

11、：回顧性分析第一部分所納入的乳頭狀癌病例。分析與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯相關(guān)的臨床病理特征，分析BRAFV600E突變對(duì)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯的獨(dú)立作用；取石蠟切片行HE染色重讀病理亞型，根據(jù)手術(shù)記錄、病理報(bào)告計(jì)算TNM分期和MACIS評(píng)分，分析BRAFV600E突變與MACIS評(píng)分的相關(guān)性；分析病理亞型、TNM分期各亞組BRAFV600E突變率的差異。
　　結(jié)果：1.年齡（OR=0.908，p＜0.001）、腫瘤最大徑（O

12、R=1.07，p=0.01）是影響頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立因素；年齡不同時(shí)，BRAFV600E突變對(duì)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用不同，多因素調(diào)整年齡、腫瘤最大徑、合并橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis，HT）、血清學(xué)相關(guān)檢驗(yàn)水平等，顯示BRAFV600E突變對(duì)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是促進(jìn)因素，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（OR=1.16，p=0.775）。2.腫瘤總直徑是影響甲狀腺外侵犯的因素，差異接近顯著（OR=1.04，p=0.064）；突變組

13、的甲狀腺外侵犯比例高，多因素調(diào)整年齡、合并HT、血清學(xué)相關(guān)檢驗(yàn)水平、腫瘤總直徑后，差異仍顯著（OR=7.452，p=0.009）；3.突變組MACIS評(píng)分平均值高，多因素分析調(diào)整合并HT、血清學(xué)相關(guān)檢驗(yàn)水平，差異顯著（β=0.42,p=0.027）；4.經(jīng)典型PTC111例，BRAFV600E突變率72.0%，高細(xì)胞型PTC13例，突變率92.3%，濾泡亞型PTC10例，沒有突變；5.突變組的IVa期腫瘤比例明顯高于野生組（14.1%

14、vs.4.8%）。
　　結(jié)論：BRAFV600E突變可能與甲狀腺外侵犯、高M(jìn)ACIS評(píng)分、高侵襲性病理亞型、高TNM分期有關(guān)，提示預(yù)后不良。與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能沒有相關(guān)性，在預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)上需結(jié)合臨床及病理特征進(jìn)一步探討。
　　第三部分BRAFV600E突變與組織NIS蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的：研究BRAFV600E突變與PTC組織NIS蛋白表達(dá)的相關(guān)性，及臨床、組織病理特征對(duì)該相關(guān)性的影響。
　　方法：

15、收集新鮮手術(shù)標(biāo)本，Western Blotting方法檢測(cè)NIS總蛋白及膜蛋白表達(dá)量；RT-qPCR檢測(cè)NIS基因SLC5A5的mRNA表達(dá)量；分析癌灶與癌旁、BRAFV600E突變組
　　與野生組在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上的差異。取石蠟切片行免疫組織熒光，分析NIS蛋白表達(dá)位置；免疫組化染色，分析NIS蛋白表達(dá)位置和表達(dá)量，IPP6.0軟件計(jì)算NIS蛋白表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析影響NIS蛋白表達(dá)的臨床病理特征，分析BRAFV600E突變與NIS蛋白

16、表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1. WesternBlotting顯示，癌旁組織NIS總蛋白量低于癌組織，但膜蛋白量高于癌組織；突變組的NIS總蛋白及膜蛋白量均低于野生組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2. RT-qPCR顯示，癌旁組織NIS-mRNA表達(dá)量低于癌組織，突變組NIS-mRNA表達(dá)量低于野生組，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3.免疫熒光顯示，癌旁組織可見NIS膜表達(dá)，癌組織未見明顯膜表達(dá)。突變組NIS熒光強(qiáng)度低于野生型組；4.免疫組化分析，癌組織細(xì)

17、胞NIS多見胞漿表達(dá)，核表達(dá)及膜表達(dá)較少；臨床病理特征（年齡、性別、各項(xiàng)血清學(xué)檢驗(yàn)水平、腫瘤直徑、多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、合并良性腫瘤、合并HT）對(duì)NIS蛋白表達(dá)無明顯影響。BRAFV600E突變是抑制NIS蛋白表達(dá)的因素，多因素調(diào)整年齡、合并HT、血清學(xué)相關(guān)檢驗(yàn)水平后，仍是抑制作用，但差異不顯著（β=-0.0195，p=0.085）。在不合并HT的亞組，突變是抑制NIS表達(dá)的獨(dú)立因素（β=-0.0257，p=0.046），在合并HT的亞組