家蠶黃紅繭品系中Cameo2與SCRB15基因的比較研究.pdf

1、蠶絲因具有輕盈、柔軟、光滑、吸濕性好等眾多優(yōu)良性狀而深受人們的喜愛，隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強(qiáng)，健康、環(huán)保的天然彩色織物越來越受到人們的追捧。我國保存有豐富的天然彩色繭資源，色彩豐富（有淡黃、金黃、稻草色、肉色、紅色、銹色和綠色等）。彩色繭絲中含有葉黃素、β-胡蘿卜素、黃酮類色素等，具有抗紫外線、抗氧化、抑菌等特性，對其進(jìn)行開發(fā)和利用具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　目前人們對彩色繭中顏色的形成以及色素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制不清楚，要開

2、發(fā)和利用天然彩色繭資源，必須首先搞清家蠶體內(nèi)色素的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制。早期的研究結(jié)果表明，Cameo2和SCRB15基因同屬于清道夫受體家族，但是其編碼的蛋白在家蠶絲腺壁上可以特異性的結(jié)合不同種類的色素，其中Cameo2負(fù)責(zé)結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)葉黃素，SCRB15則特異性地結(jié)合β-胡蘿卜素。
　　在本研究中，選擇Cameo2和SCRB15這兩個在家蠶黃紅繭品系繭色形成途徑中起關(guān)鍵作用的清道夫受體家族的成員作為研究對象，利用常用分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合

3、生物信息學(xué)分析，對二者進(jìn)行了初步的比較研究。主要結(jié)果如下:
　　1、家蠶銹繭基因CRB15與黃繭基因Cameo2全長CDS序列的克隆及序列比對
　　首先檢測了SCRB15與Cameo2在4個黃紅繭品系不同組織的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在4個品系的絲腺組織，SCRB15基因僅在銹繭品系表達(dá)，而Cameo2僅在黃繭品系中表達(dá)。接著以銹色繭品系10-200及黃繭品系柬埔寨、03-210的cDNA為模板，分別擴(kuò)增了銹繭品系的SCRB15與黃繭

4、品系的Cameo2基因的全長CDS序列，發(fā)現(xiàn)SCRB15基因的CDS全長為1515bp，預(yù)測編碼504個氨基酸，Cameo2基因的CDS全長為1482bp，預(yù)測編碼493個氨基酸。10-200的SCRB15基因的CDS序列與c44相比僅在編碼區(qū)第622位存在1個堿基的差異，而柬埔寨及03-210中Cameo2基因的CDS序列同黃繭品系N4完全一致。
　　2、Cameo2和SCRB15的生物信息學(xué)比較分析
　　利用氨基酸序列比

5、對、結(jié)構(gòu)域預(yù)測等生物信息學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)兩個基因的氨基酸序列相似性約為27％，SCRB15的第215～289位氨基酸與Cameo2相應(yīng)位點(diǎn)的序列相似性最低。SCRB15胞外域包含404個氨基酸，C端、N端各有一個短的跨膜區(qū)。Cameo2胞外域包含407個氨基酸，其C端、N端也各有一個短的跨膜區(qū)。
　　利用同源建模的方法，發(fā)現(xiàn)Cameo2和SCRB15胞外域中均預(yù)測到一個由反向平行β折疊片構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與B族Ⅰ型清道夫受體

6、(SR-BI)分子內(nèi)運(yùn)輸膽固醇酯的通道十分類似，推測該桶狀結(jié)構(gòu)可能對于特定類胡蘿卜素分子的選擇性識別及轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。Cameo2通道結(jié)構(gòu)內(nèi)有6個位置靠近的酸性和堿性氨基酸殘基，SCRB15通道內(nèi)有5個靠近的酸性和堿性氨基酸殘基，可能會與特定類胡蘿卜素分子發(fā)生相互作用。SCRB15通道內(nèi)側(cè)兩個關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈均比Cameo2要大得多，而葉黃素分子比β-胡蘿卜素分子大，推測SCRB15分子胞外域通道不能容納葉黃素分子通過，從而起到

7、對于類胡蘿卜素分子的選擇性作用。
　　3、Cameo2和SCRB15的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備
　　分別將Cameo2和SCRB15的胞外域部分連入表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了可溶性蛋白，過柱純化后獲得了較純的重組蛋白。同時利用原核表達(dá)獲得的SCRB15的包涵體，進(jìn)行電洗脫純化后，免疫家兔，制備多克隆抗體，抗體效價(jià)大于1∶3200。
　　4、SCRB15的時空表達(dá)模式分析
　　

8、利用Western blot技術(shù)，在蛋白水平檢測了SCRB15的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因在10-200、03-510、03-520這3個銹繭品系中表達(dá)量均很高。分別檢測SCRB15基因在03-520五齡幼蟲不同發(fā)育時期的表達(dá)模式后發(fā)現(xiàn)，在五齡第1天的絲腺開始檢測到很少量SCRB15蛋白的存在，隨著絲腺的發(fā)育，SCRB15蛋白的含量逐漸增加，并在五齡第4天含量達(dá)到最大值。
　　5、SCRB15胞外域重組蛋白的體外功能驗(yàn)證
　　利用