中紅側(cè)溝繭蜂觸角化學(xué)識(shí)別相關(guān)基因鑒定及表達(dá)特征分析.pdf

1、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator(Haliday)屬膜翅目，繭蜂科。該蜂是棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)和粘蟲Mythimna separata(Walker)主要的寄生性天敵，同時(shí)也可寄生夜蛾科其他昆蟲，寄主范圍多達(dá)40余種，是控制害蟲種群密度的重要自然因子。目前，在我國已實(shí)現(xiàn)該蜂的大量繁殖，并通過人工釋放用于田間棉鈴蟲等重要害蟲的生物防治。研究證明，寄生蜂的化學(xué)識(shí)別在寄主定位中具有舉

2、足輕重的作用，而寄生蜂在復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境中成功找到合適寄主又是其控制害蟲、繁衍種群的首要條件。針對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂化學(xué)識(shí)別機(jī)制開展深入研究，可以幫助我們通過調(diào)控寄生蜂化學(xué)識(shí)別行為，提高田間寄生效率，從而使中紅側(cè)溝繭蜂在害蟲生物防治中發(fā)揮更大的作用。本文對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂觸角的化學(xué)感器類型及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，通過二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，從該蜂觸角中鑒定了大量參與化學(xué)識(shí)別的受體基因，并對(duì)嗅覺受體(IRs和ORs)及氣味結(jié)合蛋白OBPs在

3、觸角中的表達(dá)模式進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:
　　中紅側(cè)溝繭蜂雌雄蜂觸角分為柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)三部分。鞭節(jié)由16個(gè)亞節(jié)組成，雄蟲觸角鞭節(jié)明顯長于雌蟲觸角鞭節(jié)。掃描電鏡結(jié)果顯示，觸角表面分布8種不同形態(tài)的感器，包括:毛形感器、刺形感器、板形感器、錐形感器類型Ⅰ、錐形感器類型Ⅱ、錐形感器類型Ⅲ、腔錐形感器和鐘形感器。其中，板形感器和錐形感器類型Ⅱ表面具有微孔，感器腔內(nèi)分布大量神經(jīng)元樹突，為嗅覺感受器;錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ表面未發(fā)現(xiàn)微孔，頂

4、端具有明顯的孔狀結(jié)構(gòu)，為味覺感受器，其中錐形感器類型Ⅲ僅分布在雌蟲觸角表面。
　　采用Life Technologies公司研發(fā)的Ion ProtonTM基因測序儀對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，共鑒定60個(gè)氣味受體（MmedORs）、6個(gè)離子型受體（MmedIRs）和2個(gè)味覺受體(MmedGRs)。利用RACE-PCR技術(shù)獲得40個(gè)ORs、6個(gè)IRs和2個(gè)GRs的全長序列。RT-PCR結(jié)果顯示MmedOR2，MmedOR26,

5、 MmedOR28, MmedOR29, MmedOR31, MmedOR32, MmedOR34, MmedOR36-OR43,MmedOR45,MmedOR46,MmedOR48,MmedOR49,MmedOR50,MmedOR52和MmedOR53在雌蟲和雄蟲觸角中特異性表達(dá)，表明這些基因在寄生蜂觸角嗅覺識(shí)別中發(fā)揮重要作用。6個(gè)IR基因和2個(gè)GR基因幾乎在所有檢測組織中均有分布。qRT-PCR結(jié)果顯示25個(gè)OR基因（MmedOR1

6、5，16,18,20,21,22,23,24,25,29,30,31,33,34,35,36,37,41,43,45,47,48,49，50和52）在雌觸角表達(dá)水平高于雄觸角，表明這些基因在雌蜂尋找寄主過程中發(fā)揮重要作用。MmedOR19和MmedOR26在雄觸角的表達(dá)高于雌觸角，暗示這兩個(gè)基因可能參與雄蜂對(duì)雌蜂性信息素的識(shí)別。味覺受體MmedGR64f在雌觸角高表達(dá)，可能參與雌蜂觸角味覺識(shí)別。6個(gè)IR基因均在觸角中高表達(dá)，MmedIR

7、8a，MmedIR25a.1，MmedIR25a.2，MmedIR64a和Mm edIR76b在雌觸角的表達(dá)水平高于雄觸角，表明這5個(gè)IR基因可能在雌蜂寄主識(shí)別中發(fā)揮重要作用。
　　利用Illumina HiSeq2500對(duì)中紅側(cè)溝繭觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重測序，共鑒定17個(gè)IR基因，其中11個(gè)為新基因。進(jìn)化分析表明10個(gè)IR基因編碼“antennal IRs”7個(gè)IR基因編碼“divergent IRs”?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，觸角表達(dá)的I

8、R25a同源基因，MmedIR25a.1和MmedIR25a.2，為串聯(lián)重復(fù)基因。組織及發(fā)育階段特異性檢測(RT-PCR)，發(fā)現(xiàn)IR基因具有廣泛的表達(dá)特征，在成蟲不同組織、幼蟲和蛹期均有表達(dá)。定量分析(qRT-PCR)結(jié)果顯示，多數(shù)IR基因在成蟲觸角表達(dá)水平高于身體，表明IR基因家族參與寄生蜂觸角化學(xué)識(shí)別功能。熒光免疫組織化學(xué)方法對(duì)IR基因共表達(dá)受體MmedIR8a在觸角中的細(xì)胞定位進(jìn)行研究，結(jié)果表明MmedIR8a在嗅覺神經(jīng)元的細(xì)胞體

9、和樹突膜表達(dá)，軸突未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，此外表達(dá)MmedIR8a的神經(jīng)元樹突末端延伸至板形感器內(nèi)部，表明在寄生蜂觸角中IR基因可能分布在板形感器。
　　中紅側(cè)溝繭蜂HiSeq2500觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析，新鑒定107個(gè)MmedORs，結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明中紅側(cè)溝繭蜂觸角表達(dá)169個(gè)MmedORs。系統(tǒng)發(fā)育分析將MmedORs劃分為不同亞家族，亞家族中的多數(shù)MmedORs與毀側(cè)溝繭蜂的Microplitis demolitor ORs具有高

10、的序列一致性(＞70％)，表明OR基因在兩種寄生蜂中具有保守的功能。對(duì)OR“R”亞家族中的6個(gè)成員(MmedOR98，124，125，126，131和155)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，表明這6個(gè)OR基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，每個(gè)基因均由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，并且相同位置的外顯子大小相似?；蚪M中，這6個(gè)OR基因銜接排列，形成了明顯的OR基因簇，并且基因的編碼區(qū)具有相同的轉(zhuǎn)錄方向，相鄰基因之間具有短的基因間距。RACE-PCR和RT-PCR對(duì)

11、OR基因簇成員的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因簇成員之間獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，此外在基因組中相鄰的MmedOR124和MmedOR98部分轉(zhuǎn)錄為雙順反子mRNA（bicistronic mRNA，bmRNA）。原位雜結(jié)果表明，以上6個(gè)OR基因在雌蟲觸角中表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目不同。通過與嗅覺共表達(dá)受體Orco的共表達(dá)分析，證明MmedOR基因表達(dá)的細(xì)胞類型為嗅覺神經(jīng)元。雙色熒光原位雜交對(duì)MmedOR12和MmedOR98進(jìn)行共定位研究，發(fā)現(xiàn)盡管這兩個(gè)基因通過R

12、T-PCR檢測到共轉(zhuǎn)錄，然而，在雌蟲觸角神經(jīng)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)兩者共表達(dá)，表明在觸角中這兩個(gè)基因主要轉(zhuǎn)錄為獨(dú)立的mRNA，并且在不同的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。
　　利用原位雜交技術(shù)，對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂18個(gè)OBP基因在雌雄蜂觸角的表達(dá)分布進(jìn)行研究。雌雄觸角共檢測到11個(gè)OBP基因的表達(dá)(MmedOBP1～8，14，18和19)。剩余7個(gè)基因(MmedOBP11～13，15～17和20)在雌蟲和雄蟲觸角均未檢測到，推測可能由于這些基因表達(dá)量較低，超出原

13、位雜交檢測的閾值。對(duì)觸角組織切片中OBP探針標(biāo)記的細(xì)胞分布位置進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)OBP基因探針標(biāo)記的細(xì)胞分布在觸角感器下方。其中，MmedOBP2、MmedOBP6和MmedOBP7分布在雌蜂和雄蜂板形感器下方，MmedOBP14僅在雄蜂板形感器下方表達(dá);MmedOBP18和MmedOBP1分別在雌蜂和雄蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅱ下方表達(dá);MmedOBP3在雄蜂錐形感器類型Ⅰ、雌蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ下方表達(dá);MmedOBP4和Mme