多基因遺傳修飾豬體外抑制豬流感病毒增殖的初步分析.pdf

1、豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、高度接觸性的群發(fā)性呼吸道傳染病，能夠造成豬群免疫抑制，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大危害，同時會給人類健康構(gòu)成威脅，具有重要的公共衛(wèi)生意義。RNA干擾(RNA inierference，RNAi)是在進(jìn)化過程中高度保守、由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的高效特異性地降解同源mRNA的現(xiàn)

2、象，能特異抑制病毒基因的表達(dá);Mx蛋白是Ⅰ型(α/β)和Ⅲ型(λ)干擾素(IFN)誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞自身天然抗病毒活性的關(guān)鍵效應(yīng)分子，是一種廣譜的抗病毒蛋白?，F(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)，生產(chǎn)性狀與抗性性狀之間存在一定程度的遺傳拮抗，單純追求高產(chǎn)目標(biāo)通常導(dǎo)致豬抵抗力降低;通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造豬的遺傳性狀，提高機體免疫力，可能是控制傳染性疾病的有效手段。
　　本實驗室前期篩選出RNAi、Mx和4shRNA三個基因，并在細(xì)胞水平或小鼠體內(nèi)或者靜脈豬體內(nèi)證實

3、證明三個基因具有抗病價值。在此基礎(chǔ)上本研究探索將這三個基因聯(lián)合構(gòu)建到慢病毒載體中，包裝慢病毒后感染豬胎兒成纖維細(xì)胞制備核供體細(xì)胞，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得F0代克隆豬。運用分子生物學(xué)方法PCR、Southern blot、RT-PCR、Western blot分別在DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平對F0代豬進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明，3頭F0代克隆豬均為陽性轉(zhuǎn)基因豬;選取其中一頭與同品種野生型豬(WT)進(jìn)行雜交，繁育F1代轉(zhuǎn)基因豬。利用上述分

4、子生物學(xué)方法對F1代轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行分析，結(jié)果表明4頭F1代轉(zhuǎn)基因豬中1頭有外源基因的整合和表達(dá)，為陽性轉(zhuǎn)基因豬。證明表達(dá)4shRNA-Mx-RNAi多基因轉(zhuǎn)基因豬轉(zhuǎn)入的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳至F1代。
　　為進(jìn)一步探究F1代轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞的抑制流感病毒復(fù)制效果，本研究分離培養(yǎng)1日齡F1代轉(zhuǎn)基因豬尾組織成纖維細(xì)胞，100TCID50A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株感染后，通過間接免疫熒光(IFA)、實時熒

5、光定量PCR(Real-time PCR)、病毒滴度測定分析了F1代轉(zhuǎn)基因豬在細(xì)胞水平上抑制流感病毒復(fù)制的活性。結(jié)果表明，在攻毒后不同時間點，與非轉(zhuǎn)基因豬和WT豬相比，轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞能夠抑制流感病毒增殖:感染流感病毒后各時間點，外源基因都有一定的抑制流感病毒的活性，而在16h時抑制效率達(dá)到最高，IFA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞對流感病毒的抑制效率高于非轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬，細(xì)胞中H1N1PB2基因復(fù)制效率比WT降低2倍，細(xì)胞上清中病毒